再创|基因线路的设计原则（二）

 细胞通过启动基因的表达实现对信号的响应，应对多样的环境，进行胞间通讯以及形成复杂的模式。工程师们试图利用这种能力对细胞进行编程，使得其能够执行特定功能，或创造复杂的化学物质或材料。本文总结了能够协助构建遗传线路的工具，列举了组装遗传线路时的常见问题模式及解决方法，并讨论了遗传线路在活细胞中发挥作用的限制。总体来说，先进的工具、表征良好的元件以及对遗传线路构建的全面认识，正推动着工程细胞在更尖端领域（从疾病治疗到功能材料制造）应用实现更多的突破。

 本文为 再创|基因线路的设计原则 第二部分，第一部分内容详见 再创|基因线路的设计原则（一）。

作者：高元力 中国科学院大学本科生

编辑：孟凡康，邓婷月

原文以Principles of genetic circuit design发表在《Nature Methods》

全文约4000字，阅读时间约为10分钟

基因线路的常见故障模式

Figure 1. 组装元件以构建复杂线路

左：NOT gate; 右: oscillator 

逻辑门可以组合起来构建更大的基因线路，实现更复杂的计算操作。为了实现连接，线路必须先被拆分成元件，然后再重新按照特定的顺序组合，而这样将会把元件置于新的环境中，因此其性能可能发生变化。而不同的线路可能使用相同的元件（如终止子），这些元件在大型线路中也会相互干扰。本节中我们将讨论构建大型线路的故障模式及其对基因线路的影响和解决方法。

模式一：响应函数不匹配

Figure 2. 响应函数不匹配的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

响应函数不匹配是指上游线路的输出范围没有涵盖激发下游线路所需要的动态范围。

在数字逻辑中，这种不匹配会造成整个线路动态范围的减小或功能的丧失（Figure 2）。通过选择调整各个逻辑门的阈值的元件，可以纠正这种不匹配。例如，可以对RBS进行突变，使逻辑门的阈值落在上游线路产生的动态范围内。

在振荡器中，这种不匹配可以抑制振荡或迫使系统偏离功能参数空间（Figure 2）。通过数学模型预测功能参数空间，选择合适的RBS和启动子来简化线路设计，同时达到所需的表达水平。

模式二：启动子环境改变

Figure 3. 启动子环境改变的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

启动子两侧DNA序列发生改变时，其功能也可能发生变化。例如，长度小于50bp的启动子在新环境的行为可能会不同，因为大肠杆菌RNA聚合酶的结构域可以结合到转录起始位点的上游约100bp处。

在数字线路中，启动子效率的降低会造成逻辑门响应的衰减，并降低整个线路的输出(Figure 3)。在振荡器中，启动子强度减弱会降低抑制物的表达，从而增加振幅，延长周期。绝缘子序列可以通过对启动子两侧DNA序列的标准化削弱环境影响。

模式三：RBS环境改变

Figure 4. RBS环境改变的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

启动子被融合到不同的RBS中时，线路输出也可能会受到影响。启动子对转录起始位点附近的DNA序列比较敏感，因为该区域可以影响启动子融化（promoter melting) 和聚合酶逃逸频率 (polymerase escape frequency)。

转录起始位点也会受到周围序列的影响而产生波动，周围的序列环境可以通过改变5'非翻译区(untranslation region, UTR)的长度和mRNA的二级结构影响RBS的强度。串联启动子可以产生特别长的5 ' UTR，通过与RBS或开放阅读框中的序列配对，加剧这种效应。当5 ' UTR的突变导致这种发夹结构完全阻塞RBS从而阻止翻译时，线路可能完全失效(Figure 4)。

这种问题的解决方案之一是通过核糖酶或CRISPR对5 ' UTR进行切割。而绝缘子元件既可以标准化mRNA的5 '端，又可以标准化启动子下游区域的转录起始序列，起到双重功能。采用双顺反子设计（上游RBS保持mRNA的伸展状态）启动翻译过程，下游RBS可以进一步与周围环境隔离。

模式四：转录通读

Figure 5. 转录通读的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

在单顺反子设计的基因线路中，如果不能完全隔离每个顺反子(如终止子不够强)，则可能会影响到本该独立调控的基因的表达，造成未诱导的基因的表达泄露(Figure 5)。串联的强终止子可以被插入基因的周围，以确保单个操纵子的独立表达。最近独立于Rho的终止子库已经被建立和表征，以保证大型基因线路在通读和同源重组方面的鲁棒性。

模式五：元件连接序列干扰

Figure 6. 元件连接序列干扰的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

当连接不同的元件时，由于DNA序列蕴含了丰富的信息，可能在连接处产生一个新的功能序列。如果连接处的序列是一个类似于调控元件的DNA序列，那么就可能产生类似于启动子或终止子等调控元件的功能(Figure 6)。大型基因线路许多元件必须以新的顺序组合，从而可能产生干扰基因表达的意外效果。发现非预期功能序列的一种方法是使用搜索各种调控元件的计算机算法扫描序列。

模式六：元件间串扰

Figure 7. 元件间串扰的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

当调控元件与彼此的目标相互作用时，可能会发生串扰，这会改变基因线路的拓扑结构，并可能导致线路故障。例如，抑制因子和非同源启动子之间的串扰可能会不适当地降低基因的表达(Figure 7)。为了避免串扰，需要测试启动子和调控元件的每个组合的正交性。

模式七：重组

Figure 8. 元件间串扰的影响(红线)

左：NOT gate; 右: oscillator

许多线路重复使用相同的调控元件，这可能导致同源重组。同源重组可以删除重复序列之间的DNA，导致元件丢失和线路故障(Figure 8)。一般情况下，重组率随着线路毒性和同源DNA长度的增加而增加，阈值在20~30bp之间。使用有足够序列多样性的相同功能的元件库，可以避免同源重组。

合成线路与宿主之间的相互作用

基因线路基于活细胞内的生化相互作用。大多数基因线路利用宿主的资源发挥功能，包括转录和翻译机制(如核糖体和RNAP)、DNA复制元件或代谢物(如氨基酸)。这些资源的可获得性和细胞内环境在不同的菌株背景、环境条件和培养基中有显著的变化，而且它们还取决于细胞密度和生长速度。合成线路可能会因为与宿主之间的相互作用而失效，因而更好地理解这些失效模式是什么，以及自然系统用来克服它们的方法，将为合成线路的组装带来新的设计规则。

宿主过载

Figure 9. 宿主过载示意图及影响

一些合成调控因子可能导致生长缺陷，然而有些调控因子能够在高水平上表达而对生长没有明显影响，而其他一些调控因子却非常有害。这种毒性的原因尚不清楚，因为它与基因组中预期结合数量和用RNA-seq测量的脱靶基因表达量无关。另一个毒性来源是T7 RNAP与强T7启动子的结合。目前也不知道这种毒性是如何产生的，可能是由于难以终止T7 RNAP, 导致的质粒上的过度转录或解耦RNAP和核糖体的延伸，暴露mRNA。基于蛋白质与蛋白质相互作用的回路，当蛋白质与目标外的配体结合时也会表现出毒性。具有类RBS序列sRNA也可以通过与核糖体结合，增加表达差异性以及减缓生长引起毒性(Figure 9)。

基因线路还可以通过垄断宿主资源和减慢必需蛋白和mRNAs的产生来减缓生长。当将线路应用于依赖于高产量的工业时，即使是生长速度的的小幅降低也可能是个大问题。生长速度的降低会降低线路元件的稀释速度，并导致蛋白质或RNA的意外堆积，从而导致线路发生故障。另一方面，生长受到阻碍时，由于稀释速度的减慢，转录因子和报告分子积累，线路的功能似乎会更好。生长速度的减慢也会对宿主施加压力，宿主通过同源重组、点突变、缺失或拷贝数减少，来进化摆脱累赘的线路。

“排队”(queuing)

Figure 10. “排队”示意及影响

当基因线路过度使用与其他细胞反应过程共享的有限资源资源时，可能会导致“排队”，从而导致线路活动的延迟或减少。例如，当过表达σ因子时，它们可以占据所有核心酶，所以不同的σ因子必须竞争与核心酶的结合，从而干扰正常的活动。

当线路中含有多个包含C端CIpXP蛋白酶降解标签的调控因子时，如果有太多蛋白质被用于降解，酶促过程就会不堪重负，导致底物必须等待处理。而调节因子的快速降解对动态线路非常重要，如果调节蛋白积累，振荡器就会失效(Figure 10)。

回溯性(retroactivity)

Figure 11. 回溯性示意及影响

回溯性指下游基因元素对上游基因元素的影响，描述了将新的下游模块连接到基因线路中导致的线路行为的变化。例如，将第二个输出连接到NOT gate可能会竞争阻遏物导致其远离最初的启动子，导致积累抑制最初启动子所需的阻遏物的时间延长，影响NOT gate的动力学特征。回溯性造成线路对输入刺激的响应延迟，而这可以通过提高受影响的元件的表达量来缓解；然而表达量的增加可能带来其他需要权衡的考虑，如毒性。

菌株改变

菌株改变会以不同方式影响基因线路的性能。生长速率、核糖体浓度和诱导延迟时间的差异是导致线路性能随菌株变化的主要因素。

Figure 12. 菌株改变示意及影响

环境条件改变

Figure 13. 环境条件改变示意及影响

培养基和生长条件也可以通过改变启动子活性、蛋白质稳定性和调节剂稀释程度来影响线路性能。这些影响可能非常严重，从LB培养基换到Min培养基可能导致线路故障。

减少基于菌株和培养基的线路改变的一种方法是使用参考标准来报告线路性能。为此可以引入相对表达单元(relative expression unit, REU)作为报告启动子活性的标准。REUs通过在相同菌株内标准化测量组成型启动子的表达，以确定其启动子活性。在将不同实验室、菌株和培养基之间的数据进行比较后，发现REU测量产生了可靠的、可重复的数据，这对于使用启动子作为输入和输出的转录线路非常重要。在未来这将有助于大型线路的计算机辅助设计。

总结

我们现在拥有多于100个正交的、新的调控因子，理论上可以用于构建堪比细菌天然网络规模的合成调控网络。而挑战在于如何设计和构建这种规模的综合调控网络。要构建和测试这种规模的大型网络，有几个前提条件：

第一，必须开发辅助设计的计算工具。这些程序必须能够模拟基因线路的动力学过程，并且将设计转变为基因元件的线性组装。由于大部分元件将在新的遗传环境中使用，绝缘DNA序列将在未来的基因线路中至关重要。

第二，必须将全细胞组学测量的新方法整合到调试过程中。目前基因线路的输出过于依赖荧光蛋白，而现在转录组学方法足够便宜，并且可以用于推断线路内部多种元件的聚合酶通量。而其他单分子方法，如核糖体和RNAP图谱(mapping)，将会在实验方法变得更常规时发挥重要作用。

第三，需要开发新的方法，能够在一些难以控制的细胞条件下快速测试基因线路。基因线路对核糖体的数量、可用的RNAP的数量、细胞的氧化还原状态、生长温度和ATP浓度等参数都很敏感，而这些参数在不同的细胞类型和条件下都会发生变化。然而，这些参数很难在不影响宿主的情况下在细胞中测量。因此用体外无细胞方法进行线路调试的方法的发展，将有助于设计对上述条件的变化更具有鲁棒性的基因线路。

新的生化方法、调谐旋钮和故障排除方法正在被整合以用于复杂线路的设计和构建。在同一基因线路中可以使用不同种类的调控元件来实现特定的功能，而每种调控元件都能在更大的线路中找到自己合适的应用位置。例如，数字线路可以集成感受器以及相应环境信号，模拟线路可以用少量的调控元件实现算法功能。重组酶可以储存记忆或造成不可逆的翻转。CRISPRi基本上可以调控基因组中的任何基因。总的来说，这些新的线路，以及连接和调试基因线路的工具和方法，将开启一个细胞编程的新时代，以及伴随这一伟大能力而来的广泛应用。

Figure 14. 一种治疗性细菌的概念线路. 基于阻遏器的逻辑门对环境状态做出动态响应,重组酶（右）记录观察结果；模拟线路（左）用来计算药物的剂量率，如果药物的剂量超过这个数值，CRISPRi就会敲除特定的宿主基因，从而抑制生长，避免过度用药

参考文献：

[1]Brophy J A N , Voigt C A . Principles of genetic circuit design[J]. Nature Methods, 2014, 11(5):508-520.