白泽专栏 ｜ CAR-T转基因技术盘点（下篇）
截止撰稿前（2018年2月6日），在ClinicalTrial.gov上搜索“CAR T”可以检索到391项CAR-T相关的临床研究。
其中，中国大陆区是159项，韩国1项，台湾2项，日本4项。值得关注的是美国总共153项临床研究（主要分布在加州，宾夕法尼亚州和德克萨斯州），在总数量上中国已经超过美国成为CAR-T相关临床试验的第一大国。
然而，在CAR-T的生产过程中，一个重要的环节就是修饰基因的导入系统如何解决如下问题：
1）低毒性、高水平、稳定的基因转移到宿主细胞；
2）安全，即低水平的基因毒性和免疫原性；
3）经济可行性，即可接受的费用（按病人的标准计算）的基因导入系统是值得关注的课题。
各个国家CAR-T相关的分布图
而继上一篇《白泽专栏丨CAR-T转基因技术盘点（前篇）》之后，我们为大家带来了《白泽专栏丨CAR-T转基因技术盘点（后篇）》。
3. Lentivirus（慢病毒导入系统）
根据最近对病毒分类学国际委员会（ICTV）的分类，慢病毒属于逆转录病毒科，目前包含九种：七种动物慢病毒和两种人慢病毒。动物慢病毒是牛免疫缺陷病毒（BIV），山羊关节炎脑炎病毒（CAEV），马传染性贫血病毒（EIAV），猫免疫缺陷病毒（FIV），美洲狮慢病毒（PLV），猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和维斯那/马蒂病毒（VMV）。人类物种是众所周知的人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）和人类免疫缺陷病毒2（HIV-2）。
由慢病毒引起的疾病的第一次实际描述来自1843年法国马传染性贫血的观察。后来，在20世纪50年代冰岛出现了由VMV引起的绵羊慢性进行性疾病，这种疾病代表了严重的形式的肺-脑病。在20世纪60年代，美国研究人员确定了牛的白血病和淋巴肉瘤的病因学，致病因子是逆转录病毒（BIV），形态上类似于VMV。
图12 经典的慢病毒载体结构，一个野生型的构造
然而，虽然慢病毒是人类历史上最严重的流行病之一，但现在它们被广泛用于基因治疗和基因疫苗的开发。它们的用处反映在它们没有病毒蛋白并可以结合到靶细胞中。
此外，慢病毒载体（由上述复合逆转录病毒开发）具有克服简单逆转录病毒载体限制的性质。这些包括病毒颗粒的较高稳定性和较低的插入诱变频率。它们可以转导高度分化的细胞如树突状细胞这一事实对于它们在免疫疗法中的应用至关重要。
4. Retrovirus（逆转录病毒导入系统）
成功的基因治疗需要靶细胞中基因的长期表达。基因导入模式的效率显然与DNA整合入宿主的成功相关。由于野生型病毒成功的感染率，慢病毒已经引起了很多年的研究兴趣。
慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞，这是感染细胞系的许多治疗的关键因素。HIV-1的长末端重复区（LTR）是修饰的目标区域; 该序列是病毒DNA整合入宿主细胞的介质。Env蛋白可以用配体和抗体修饰以靶向具体的细胞类型。
载体转导的方法包括识别靶细胞表面分子的病毒包膜上的特异性抗体（例如识别靶细胞上的CD20的病毒包膜上的αCD20; CD20是B细胞上的抗体）以及单独的，修饰的，融合糖蛋白附着于宿主细胞。
图13显示了一个早期简单的慢病毒载体，它进入细胞，通过内吞将病毒摄入细胞。病毒在内涵体内并融合到其膜上，促使病毒和内体膜打开并将衣壳释放到细胞中。从那里并且治疗性基因被掺入到靶细胞中。载体被包装成具有转录后活性元件的病毒结构，旨在调节和增强转基因表达。这些辅助包装载体含有重要的启动子，拓宽宿主识别范围的糖蛋白，以及防止重组和载体动员的非人特异性病毒序列。
图13 逆转录病毒的感染流程
慢病毒是逆转录病毒的亚型。慢病毒和标准逆转录病毒的主要区别从实验的角度看是慢病毒能够感染非区分并积极分裂细胞,而标准的逆转录病毒只能感染有丝分裂活跃的细胞类型。所以，lentiviruse感染的细胞更多。
图14.制备慢病毒载体和逆转录病毒载体
慢病毒用包装细胞系（293T / 293FT）与表达cDNA / shRNA的转移质粒一起共转染产生慢病毒载体以及编码结构和包膜（典型为VSV-G）蛋白质的两种辅助/包装质粒。包装细胞产生感染性颗粒，其基因组仅编码来自转染质粒的序列，其可用于转导靶细胞。 逆转录病毒载体以与慢病毒产生相似的方式发生，主要区别在于最初的步骤是用单一质粒转染。 将质粒单独转染到已包含辅助构建体的包装细胞系（Phoenix）中。
目前有两种方法可以完成与载体基因整合即病毒系统和非病毒系统。基础研究和临床研究中基因治疗的主要载体是病毒，因为转染效率高，达到临床必需数量的培养T细胞所需的时间相对较短，以及具有不同表达特征的不同病毒。病毒载体包括逆转录病毒（包括慢病毒），腺病毒和腺相关病毒。在CAR-T的制备中，已经都有相关的报道。
但是，病毒载体会造成安全隐患。用于诱导免疫反应的插入突变可导致肿瘤发生和毒性，载体容量有限，实现的效价不够高。非病毒基因治疗由于其更高的效率，靶向特异性，非感染性，无限的载体容量，受控的组成和丰富的生产，一直保持其作为癌症治疗方法的重要地位。如下表列举了比较著名公司机构的转染方式。其中MD Andersen等机构也使用转座系统修饰T细胞并应用于临床。
表3 CAR-T 研究开发的司和合作机构以及转染方式
5. CAR T细胞治疗的制造
目前CAR-T细胞的产业化优化在不断的进行中，各地都逐渐建立了GMP生产车间。
如图5所示，BioMedica公司的Lentiviral Vector即是Novartis第一个被FDA批准的CAR-T产品的Vector的生产商。
图15牛津BioMedica公司制造的Lentiviral Vector。经过几轮过滤和测试以确保高品质的产品
在随后的CAR T细胞生产过程中，一致的载体质量可以最大限度地降低位点缺失的变异。为了提供足够大小的批次以支持临床和商业需求，经过设计和优化的工艺，以在几周内一系列多个小批量载体。一旦子批次被证明符合该制造阶段的关键规格，则选择特定的子批次进行填充，并且最终在一天内处理完成。
此外，一直进行稳定性测试程序，并且在T细胞制造过程中一致地执行。
相信随着产业化的推进，更高质量的CAR-T或者基因修饰的细胞产品将会给患者带来不断的福音。
最后，2018年1月29日在线发表在《Nature Review Drug Discovery》的文章对CAR-T的市场进行了分析[5]，并称2017年是CAR-T产品“Landmark”的一年，随着Novartis和Kite/Gilead两款CD19靶点的CAR-T细胞上市，并有效的治疗血液肿瘤很大程度上改变了肿瘤治疗的思路。与此同时，很多其它靶点的CAR-T细胞也在临床I期或II期（如：Bluebird和南京传奇的BCMA靶点治疗MM，Juno MUC-16靶点治疗乳腺癌等）对实体瘤的治疗也显示出良好的治疗效果。
文章预测了2026年血液瘤的市场销售额将超过200亿美金(包括ALL急性淋巴细胞白血病；DLBCL弥散性B细胞淋巴瘤；MCL套细胞淋巴瘤；FL滤泡性淋巴瘤 ；CLL慢性淋巴细胞白血病；MM多发性骨髓瘤). 其中，CAR-T的市场规模大概是10亿美金，基于Kymriah和 Yescarta的适应症，主要的市场销售在儿科和青少年的ALL（44%）和DLBCL（46%）如图所示。同时，文章也强调：CAR-T细胞治疗还属于发展的初期，很多市场的潜力特别是Off-the-shelf（即用型）产品和实体瘤的治疗将会对市场需求产生深远的影响。
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参考文献：1.Kebriaei, P., et al., Gene Therapy with the Sleeping Beauty Transposon System. Trends Genet, 2017. 33(11): p. 852-870.
2.Woodard, L.E. and M.H. Wilson, piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol, 2015. 33(9): p. 525-33.
3.Zhang, C., et al., Engineering CAR-T cells. Biomark Res, 2017. 5: p. 22.
4.Levine, B.L., et al., Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev, 2017. 4: p. 92-101.
5.Yip, A. and R.M. Webster, The market for chimeric antigen receptor T cell therapies. Nat Rev Drug Discov, 2018.