多糖疫苗制备中TFF应用
乙型流血嗜血杆菌可感染两岁以下婴儿，引发脑膜炎；其衣壳胞外多糖由多聚核糖磷酸盐（PRP）组成，是关键毒力因子，常与蛋白质化学偶联后，作为疫苗，诱导机体T细胞依赖性免疫反应。
传统的PRP分离纯化包括多步乙醇沉淀、阴离子表面活性剂处理、苯酚萃取及重复超速离心等步骤，费时费力。在本实验中，通过工艺优化，将乙醇沉淀减少为两步，同时以核酸内切酶/蛋白酶处理及切向流过滤分别替换苯酚处理和超速离心，构建一种高效、稳定且可灵活规模放大的衣壳多糖提取工艺。
细菌以补料分批模式培养，培养结束后，先以孔径0.65um的中空纤维切向流微滤膜进行培养液的澄清收获，去除细胞，获得的滤液以MWCO 100kD的中空纤维切向流超滤膜浓缩10倍，再先后以含150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液、含0.3%脱氧胆酸钠/2mM EDTA的Tris-HCl缓冲液及Tris-HCl缓冲液进行3步6体积的洗滤，获得6L初步纯化的浓缩料液。
然后，料液以30%乙醇沉淀处理，不溶性成分以0.2μm中空纤维膜过滤分离，操作时，截留液回流至进样溶液，而被浓缩，再以30%乙醇溶液进行6体积漂洗，去除不溶性成分，获得含大部分溶解PRP的滤液。滤液再以50kD中空纤维超滤膜进行浓缩。获得的浓缩液用乙酸调节pH值，再进行80%乙醇沉淀，并以0.2μm中空纤维膜进行分离，去除乙醇溶液；沉淀的PRP以纯水溶解后，以同一系统进行过滤，获得的滤液再以50kD中空纤维膜进行浓缩。
获得的浓缩液调节pH值至7.5后，以核酸内切酶/蛋白酶处理并超滤去除酶解产物，精纯的多糖样品冻干并进行质量控制分析，包括多糖含量检测、蛋白质/核酸含量检测、PRP分子量/均一性/纯度检测等。
切向流过滤是生物制药下游处理最常使用的分离技术，其可保证料液在封闭的无菌系统内处理、操作简单、对环境友好且规模放大简单。本实验中，以切向流过滤结合乙醇沉淀纯化细菌衣壳多糖，最终总回收率与传统离心技术相当，纯度良好（多糖与核酸及蛋白质含量比均在限定范围内），且纯化的多糖可被特异性抗体识别。此外，由于PRP在不同pH条件下，稳定性不同，且培养液中存在的脂质等成分可能与PRP形成聚合，因此，可对培养及纯化操作及缓冲液体系进行优化，以进一步提高回收率。
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