高浓度单抗溶液制备
简介
单克隆抗体（mAb）和其它蛋白治疗药物用于皮下注射时，通常要求浓度达到150mg/mL或以上，因为注射体积很小，一般仅为1.5mL。在此浓度条件下，蛋白质之间的短距离相互作用会导致聚集和高粘度。
切向流过滤（TFF）常用于高浓度蛋白质的生产，但很少有报道做到150mg/mL以上的浓度。高粘度导致的TFF通量的降低以及浓差极化可能导致蛋白质凝胶化、膜污染和蛋白质聚集。所以，需要使用新的概念以弱化蛋白质相互作用，降低粘度和聚集，优化TFF超滤，以便用于高浓度的皮下注射。
一些研究通过优化跨膜压（TMP）、错流速率和剪切，达到了150-200mg/mL的浓度。这些研究试图使过滤过程中的蛋白质聚集最小化，避免粘度的提升，以及相关的通量衰减和较大的轴向压力降ΔP，后两者会限制所能达到的最大mAb浓度。较大的压力降会超过泵能力，增加TMP的轴向差异，在进样端口形成较高的TMP值，而滤出端口TMP为负值。
在TFF中，通过使用合适的壁剪切或剪切率，将膜壁附近的蛋白质分子重新“扫入”料液流，可缓减污染和浓差极化。但如果剪切太大，会引起蛋白质变性和聚集，特别是存在气/液和固/液界面时。对于蛋白质，在TFF中通常会使用平面膜包，因为传统上认为其可获得更高的通量。但是其流道较“迂回曲折”，特别是在直角的"停滞区”，需要较高的局部壁剪切，才能缓减蛋白质污染和浓差极化，这可能导致蛋白质变性和聚集。相反，中空纤维的几何结构可形成更加均一的液流，避免形成较高的局部壁剪切应激，从而使由剪切导致的蛋白质聚集最小化，特别是在高浓度条件下。
低粘度、高浓度的mAb剂型设计使其更有利于使用TFF进行超滤。在TFF中，低粘度有利于获得更高的通量、更低的轴向ΔP、更好的TMP控制以及更低的壁剪切应激。
最近，通过添加高浓度（150-1000mM）共溶质来降低溶液粘度，提高mAb稳定性的策略得到了极大的关注。
本实验中，以高浓度组氨酸或咪唑及海藻糖作为共溶质，通过中空纤维切向流过滤制备稳定的人IgG1 mAb，280和255mg/mL条件下，粘度低至70和40cP。溶液的低粘度和中空纤维几何结构的选用，提供了更低的轴向ΔP，产生相对均匀且较低的壁剪切应激和更加均匀的TMP。这些因素缓和了膜壁阻滞和局部TMP轴向降低导致的通量衰减，从而可缓减膜通量的降低。获得的产物溶液在4℃条件下长时间保存，保存前后检测证明，可逆性聚集的形成极低。
实验
制备130mg/mL的IgG1 mAb 溶液和含10mM组氨酸、4%甘露醇和0.1% 吐温-80的缓冲液。TFF使用 MidiKros 50kD mPES中空纤维过滤组件，纤维内径0.5mm、膜表面积115cm^2（产品编号：D02-E050-05-N）或纤维内径1.0mm组件、膜表面积75cm^2（产品编号：D02-E050-10-N）。
TFF洗滤/超滤至250mg/mL
25mL mAb溶液用等量缓冲液稀释至65mg/mL，注入50mL离心管，温和搅拌，此作为TFF实验的回流容器。使用KrosFlo Research IIi TFF系统，以恒体积模式，对稀释的mAb溶液进行6体积洗滤，置换缓冲液，保持浓度恒定。过程中，使用KrosFlo自动背压阀，通过限制回流管路，调节压力，从而将TMP维持为0.8bar。1.0mm内径过滤组件和0.5mm内径过滤组件的进样速率分别设置为100mL/min和220mL/min，每根纤维相应壁剪切率分别为1415和8300S-1。缓冲液置换的溶液回收后，除菌过滤，4℃储存过夜，第二天再用1.0mm ID 过滤器组件浓缩至~250mg/mL。
KrosFlo Research IIi TFF 系统流路设置
浓缩时的起始进样流速控制为100mL/min，TMP维持为0.8bar。当mAB粘度增加后（>150cP），TMP将不易调节。此时，通过限制滤液管路，将TMP维持为0.8bar，即增加滤液反压，同时降低进样错流流速（降低通过过滤器组件的ΔP）。根据实时监测的滤液重量，在特定时间点，检测回流液浓度。UV检测滤过液，确认无mAb滤过。根据滤液重量的变化确定瞬时通量，数据采集时间间隔设为1分钟。最终收获250mg/mL的溶液，通过温和吸取搅拌，使溶液均质化，然后再使用DLS、UV-可见光谱法及注射器毛细管测粘法检测。
UV-可见光谱法检测mAb浓度和浊度，注射器毛细管粘度计测试mAb溶液粘度，体积排阻层析确定终溶液中溶解的可逆性聚集物水平，此外还进行了样品储存稳定性研究。
结论
中空纤维切向流过滤获得了高浓度的250-280mg/mL的mAb溶液，在含有高浓度共溶质组氨酸或咪唑的系统中，溶液粘度从300cP降低到了40-80cP。在最高蛋白质浓度下，高共溶质浓度溶液的跨膜通量高2-3倍。
在高共溶质的低粘度条件下，更小的轴向ΔP可获得更小、更均匀的壁剪切应激值以及更加均一的TMP。中空纤维几何结构的一个优势是更加均一的流道，与平面膜包“迂回曲折”、带90°转角的流道不同，后者可形成较高的局部ΔP和剪切应激。更加均一的壁剪切应激值和TMP有利于使可逆性通量衰减的速率最小化。
SEC检测显示，浓缩后溶液的可溶性聚合物<1%，单体回收率~90%。更高的单体回收率与更低的通量衰减相符。在不同温度条件的长时间储存下，使用海藻糖-组氨酸-柠檬酸系统，可溶性聚合物含量在4周后仍低于1%。
参考文献：J.J.Hung, A.U.Borwankar, B.J.Dear, et al., High concentration tangential flow ultrafiltration of stable monoclonal antibody solution with low viscosities. Journal of Membrane Science 508 (2016) 113-126.
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=m0369itffac&width=500&height=375&auto=0
更多中空纤维切向流过滤应用：
仕必纯贸易（上海）有限公司
上海市浦东新区张江路1238弄恒越国际大厦1号2层G、H座
邮箱：spectrum.cn@spectrumlabs.com
电话：400-628-4448
官网：www.spectrumlabs.com