利用 TFDF™ 技术，强化慢病毒载体生产工艺
Oxford Biomedica (OXB) 是一家领先的基因和细胞治疗公司，公司专注于慢病毒载体（LV）技术创新，已有超22年的工艺开发和生产经验。为满足不断增加的LV供应需求，OXB将GMP LV细胞培养生产平台从基于细胞工厂的贴壁细胞工艺成功转换到了使用一次性使用生物反应器的、更加稳定的无血清悬浮培养工艺，目前，该工艺已可规模放大至200L体积。但对高效生产工艺的开发来说，慢病毒载体对环境pH、盐浓度以及剪切应激的相对敏感性，仍是载体收获以及下游处理的一个挑战。本研究评估了使用Repligen Corporation（Repligen）开发的TFDF™（切向流深层过滤）技术，从来自生物反应器细胞培养上清液中收获慢病毒载体的可行性。TFDF™技术可有效地分离病毒颗粒和细胞及细胞碎片。在5L和50L规模条件下，收获收率一般可超过90%，通量在700-750LMH之间。TFDF™的切向模式对细胞非常温和，可以支持多次收获循环，这为以灌流模式提高LV载体生产提供了可能性。
慢病毒载体生产规模放大的挑战
利用慢病毒载体将治疗性转基因引入患者细胞，以进行基因治疗的方式，代表了一类独特的治疗方案，其正被用于越来越多的遗传性和获得性疾病。关键临床试验的成功、该领域内临床试验活动的增加以及基于慢病毒载体的先进治疗药物产品的获批，共同推进了对其全球产能需求的急剧增加。但是，在生物技术行业，开发可获得具有合适质量属性的慢病毒产品的生产工艺，同时满足GMP供应所需的产能和产物成本要求，仍是一个不小的挑战。OXB是开发基于慢病毒载体的产品的先驱者，已经开发了基于无血清悬浮培养哺乳动物细胞瞬时转染的商品化慢病毒生产平台。在生产过程中，“成熟”的载体颗粒分泌到上清液，需从生产细胞和细胞碎片中物理分离载体，以进行载体收获。该起始澄清步骤通常使用直流过滤方法进行，其使用合适孔径的过滤器，以保证载体透过，同时截留细胞和细胞碎片。但基于深层过滤的工艺，收率可能会不稳定，且由于细胞或载体暴露于过度的流体动力学应激条件，而影响产物质量。
切向流深层过滤：用于慢病毒分离的新技术
Repligen最近开发了一种新的过滤技术，切向流深层过滤（TFDF™），其工作时，细胞培养进样料液以切向模式通过管状深层过滤器（图1）。细胞培养进样料液穿过过滤管的内腔，截留液返回至生物反应器，滤液透过深层过滤器管壁。系统的搭建与中空纤维操作相似，但是TFDF™过滤器又与中空纤维存在显著的不同之处。中空纤维的管壁厚度一般为0.075mm – 0.2mm，内径一般为0.5mm– 1mm，通常采用mPES膜材质和各向异性结构。而TFDF™过滤器的壁厚为5.0mm，内径为4.6mm，采用聚丙烯/聚对苯二甲酸乙二醇酯以及各项同性结构（图2）。更重要的是，TFDF™的有效平均孔径为2 -5μm，即其可使病毒载体颗粒（一般直径为20-200nm）透过进入滤液，而截留更大的细胞和细胞碎片。本研究评估了TFDF™在载体生产中，以批次和灌流模式，从细胞和细胞碎片中分离慢病毒载体的可行性，研究使用生物反应器体积范围为5L – 50L。
图1. TFDF™管状深层过滤器
细胞培养进样料液沿深层过滤器管壁切向流经内腔。回流液（蓝色）返回至细胞培养进样原液，而滤液透过管壁，进入滤液容器。
图2. 中空纤维过滤器和TFDF™管状深层过滤器的比较
TFDF™技术的特点
TFDF™技术同时利用了切向流（TF）和深层过滤（DF）的优势。液流切向通过管状深层过滤器，可支持高密度料液的处理，而深层过滤器的结构和容量，可保证高产物透过（图3）。这种优势结合技术可实现高细胞密度样品的细胞分离操作，并获得高通量和高收率。过滤器单元可通过同时增加过滤管长度和单个组件内的过滤管数量而进行规模放大（图4）。
图3. 切向流驱使大部分细胞和细胞碎片回流循环，而非透过过滤器
TFDF™结合了切向流（TF）和深层过滤（DF）的优势
深层过滤器的独特结构可实现高产物透过，而以切向模式操作的深层过滤器可更为协同性地实现高细胞密度样品的高产量和高通量。
切向流深层过滤（TFDF™）系统
TFDF™技术整合了硬件、软件以及ProConnex® TFDF™流路部件。硬件/软件系统和ProConneX®流路设计用于支持1 – 2000L的生物反应器体积（图4）。ProConnex® TFDF™流路为封闭式、一次性使用、伽马辐照流路，整合TFDF™过滤器和压力传感器（进样、回流和滤液）。ProConnex® TFDF™流路采用不分公母的AseptiQuik®接头，可方便地连接至生物反应器、其它流路和容器。料液通过磁悬浮泵从生物反应器流出通过过滤器，同时，系统使用非侵入式外夹超声波流量计监测流速。
图4. KrosFlo® TFDF™ 系统和ProConnex® TFDF™流路，规模1 - 2000L。
KrosFlo® TFDF™评估方法
实验#1：批次 & 灌流模式收获HIV-GFP
为评估TFDF™技术在生产过程中，从无血清悬浮培养液中分离慢病毒载体的潜在应用，使用表达绿色荧光蛋白（GFP）报告转基因和假型水泡口炎病毒G蛋白（VSV-G）的人免疫缺陷病毒（HIV-1）载体进行了初步研究。载体以5L 玻璃搅拌罐生物反应器（STR）进行小规模生产，使用基于脂质的转染试剂，进行慢病毒表达质粒的哺乳动物细胞瞬时转染。以KrosFlo® TFDF™系统进行载体收获时，将含有表面积55cm2过滤器的ProConnex® TFDF™流路通过AseptiQuik® G接头，连接到生物反应器的两根导管，即作为生物反应器上的进样和回流导管，分别连接到ProConnex® TFDF™流路上各自对应的管路。与中空纤维切向流过滤（TFF）工艺不同的是，KrosFlo® TFDF™系统需在滤液管路上使用泵，以在载体收获时，将滤液通量控制为700-750LMH，该值作为初步工艺研究的起始点。收获含有载体的上清液后，截留在生物反应器内的生产细胞使用新鲜培养基重悬，并额外培养一段时间，以评估通过单次瞬时生产工艺，进行多次载体收获的可能性，使用初步收获所使用的相同TFDF™过滤器进行第二次载体收获。为评估TFDF™收获工艺的效率以及TFDF™收获对慢病毒功能的影响，从收获前的生物反应器和TFDF™膜收获的物料中取含有载体的上清液样品。功能性载体转导贴壁生长的人胚胎肾（HEK）293T细胞，使用流式细胞术检测转导（GFP阳性）的细胞，进行滴度定量。简单来说，病毒转导后72小时，从分析板上脱离处理的细胞，使用BD FACSVerse®流式细胞仪，结合BD FACSuite®软件，分析GFP荧光。每个样品采集10,000个独立项的大小和荧光，所有样品重复分析两次。使用合适的分析设门，计算基于非转导细胞检测的背景荧光而确定的超过荧光阈值的HEK293T细胞百分比。功能性载体滴度计算时，假定单个GFP阳性细胞为一个转导单元。
实验#2：治疗性慢病毒载体的收获
尽管使用载体表达报告基因，如GFP，的研究已经可为工艺开发提供大量的信息，但目的基因在慢病毒载体结构中的编码会影响上游和下游工艺性能。所以，工艺开发工作有必要使用与实际应用直接相关的载体结构进行评估。为评估KrosFlo® TFDF™系统收获临床相关慢病毒载体的性能，使用2个5L 搅拌罐生物反应器进行了基于马免疫贫血病毒（EIAV）的慢病毒载体生产，其表达VSV-G假型治疗性转基因。在1个生物反应器中，使用KrosFlo® TFDF™系统进行了单次载体收获，操作使用滤液通量为750LMH。在第2个生物反应器中，载体收获使用常用于悬浮培养哺乳动物细胞培养液物料澄清的商品化深层过滤器。从收获前的生物反应器以及各个澄清的收获物料中取样。所有样品中的功能性载体滴度通过转导贴壁生长的HEK 293T细胞并对转导的细胞进行免疫染色及流式细胞术定量检测。滴度使用上述方法确定，但转导的细胞在以靶向治疗性蛋白的荧光标记抗体偶联物处理后，以流式细胞术鉴定。
实验#3：工艺规模从5L提高到50L
为评估KrosFlo® TFDF™系统在适合慢病毒载体临床生产的更大规模条件下的性能，在50L一次性使用生物反应器（SUB）中进行哺乳动物细胞的瞬时转染，然后进行整合了治疗性转基因的EIAV载体的生产和澄清。所有载体生产工艺操作按已接受的工程原理进行规模放大，为处理更大的工艺体积，使用含过滤面积450cm2过滤器的ProConnex®TFDF™流路，以750LMH的滤液通量，进行载体收获。从澄清前的生物反应器以及以TFDF™膜澄清的收获物料中取样。所有样品中的功能性载体使用前文所述方法进行确定。
切向流深层过滤：用于慢病毒载体生产的新形式
本研究评估了使用TFDF™技术，以批次或灌流模式，从无血清、悬浮细胞培养中，收获慢病毒载体颗粒的可行性。TFDF™技术的性能与常用于病毒上清液澄清的深层过滤方法相当或更出色。实验可从5L规模放大到50L。
TFDF™技术的初步评估证实，在收获过程中，其可从细胞和细胞碎片中，完全分离HIV-GFP慢病毒颗粒。实验1的功能性滴度分析显示，在第一次收获和随后的第二次收获中，病毒载体可通过TFDF™膜成功回收（图5A）。为计算载体回收率，从TFDF™收获前的生物反应器中以及每个收获时间点所收集的滤液中取样分析。结果显示，生物反应器和相关滤液中的功能性滴度相似，说明TFDF™收获中，没有检测到载体损失。在该初步概念验证研究中，TFDF™滤液样品中检测的功能性滴度稍高于收获前生物反应器中检测的值（图5A）。使用TFDF™进行载体收获不会浓缩物料，所以观察到的结果可能是由于用于慢病毒载体滴度检测的分析方法本身的偏差。更重要的是，数据证实，TFDF™适用于对剪切敏感的慢病毒载体，因为在所有收获工艺中没有观察到载体功能的损失。
图5. （A）通过TFDF™膜，高效回收HIV-GFP慢病毒载体。（B）通过多次TFDF™收获，可提高工艺产量。
（A）HIV-GFP载体在单个5L STR中生产，并使用TFDF™系统从生物反应器中收获。初步收获（收获1）后，生物反应器中的细胞以新鲜培养基重悬，继续载体生产，持续数小时，然后使用相同的TFDF™系统进行第二次载体收获（收获2）。每次收获前检测生物反应器内的HIV-GFP载体滴度，并检测每次收获中，TFDF™滤液内的滴度。所有数据按生物反应器内的起始滴度进行标准化处理。
（B）相比标准的单次收获方法，收获1和收获2物料的HIV-GFP产量相加，可使整体工艺产量提高80%。所有值按TFDF™收获1进行标准化处理。
TFDF™技术的潜在优势是提高慢病毒载体的整体工艺产量，这一点可通过其以单次瞬时转染工艺而实现多次载体收获的能力而得以证实。尽管收获2样品中观察到的载体滴度低于收获1样品中观察到的滴度（图5A），但将2次收获的TFDF™滤液物料相加，相比单次收获工艺，可使整体工艺产量提高约80%（图5B）。当使用标准的深层过滤方法进行初步载体澄清时，不能进行重复收获步骤，因为过滤器会捕获细胞，使其离开生产环境。
图6. （A）收获1中的TFDF™通量及压力趋势。（B）收获2中的TFDF™通量及压力趋势。
（A）通量、进样压力和回流压力保持相对恒定。TMP稍有增加，滤液压力降低，与TMP相反。
（B）通量、进样压力和回流压力保持相对恒定。TMP增加了1.5psi，但不影响通量，滤液压力降低，与TMP相反。
使用TFDF™系统进行收获时，可使用相对较高的通量，750 LMH，且膜污染极低。通量随时间变化的趋势显示，在1小时的单元操作过程中，进样、回流、滤液压力和跨膜压（TMP）的变化相对较低（图6A）。唯一值得注意的压力增加是TMP从收获开始时的0.5 psi增加到了45 min后的约1 psi。750 LMH的通量以及低于1 psi的TMP，是TFDF™与传统TFF以深层过滤技术的重要区别，后两者通常在显著更高的TMP条件下操作。TFDF™过滤器本身结合了切向模式的设计，可将大部分细胞和细胞碎片截留在纤维内腔，而不是压向过滤器管壁，这可能是达到高通量和低TMP值的原因。
使用收获1相同的TFDF™过滤器进行收获2时，可获得相似的通量趋势（图6B）。同样，通量可维持为750 LMH约45 min。进样和回流压力保持稳定，且低于±1psi偏差。起始TMP约为1psi，之后虽稍有增加，但也仅达到1.5 psi，最终值为2.5 psi，说明，尽管部分细胞和细胞碎片限制了液流透过膜，但没有达到可影响通量的量级。
为了将TFDF™评估扩展至临床相关载体，使用基于EIAV、整合治疗性转基因的慢病毒系统，对以TFDF™系统进行慢病毒载体收获的研究，进行了重复评估。在3个独立研究中，载体使用5L STR生产，并利用TFDF™技术进行收获（图7）。与使用HIV GFP载体的结果相似，EIAV载体可高效透过TFDF™膜，平均工艺收率约为95%。LV载体收获的通量和压力趋势与HIV-GFP的结果相似（图8）。通量保持恒定为750LMH，所有压力变化低于±1psi。与使用HIV-GFP进行的实验相似的是，起始TMP约为0.5psi，之后随工艺进行，稍有增加。压力曲线的趋势显示了稳健的过滤器性能，无过滤器污染，可在1小时以内完成收获单元操作。为与使用TFDF™膜的载体收获工艺进行比较，实验使用标准深层过滤方法进行了载体收获的比较研究，在4个独立生物反应器实验中，平均载体收率仅为70%（图7）。
图7. 通过TFDF™膜高效回收治疗性EIAV慢病毒载体。
表达治疗性转基因的EIAV载体在5L STR中生产，使用标准深层过滤器方法（n = 4 STR）或使用TFDF™技术（n = 3 STR），从生物反应器收获载体。检测载体收获前生物反应器内及收获物料中的EIAV载体滴度。检测结果用于计算收获工艺的载体回收率。所有数据按相关生产生物反应器中滴度进行标准化处理。
图8. 治疗性慢病毒载体收获过程中，TFDF™系统的通量和压力趋势。
在运行过程中，所有压力值维持在±1 psi内，并可达到稳定的滤液通量。
总体来看，使用TFDF™技术可有效回收慢病毒载体，也有可能可通过多次收获方法，进一步提高工艺产量。
图9. 在50 L规模条件下，通过TFDF™膜，高效回收治疗性EIAV慢病毒载体。
表达治疗性转基因的EIAV载体在50 L STR（n = 3）中生产，载体使用合适规模的TFDF™膜从生物反应器收获。检测载体收获前所有生物反应器内以及TFDF™滤液中的EIAV载体滴度。检测结果用于确定收获工艺中的载体收率。所有数据按相关生产生物反应器内的滴度进行标准化处理。
工艺可放大性是生产技术的重要要求。所以，研究将表达治疗性转基因的EIAV慢病毒载体收获澄清工艺放大了10倍，即从5L规模放大至50L一次性使用生物反应器。评估了3个独立生物反应器研究的载体收率（图9）。在所有研究中，ProConnex® TFDF™流速进行相应规模放大。同样，当以750LMH相似的通量操作时（图7），TFDF™技术可通过恒定通量，从细胞和细胞碎片中有效分离LV载体，单元操作可在约1小时内完成。滤液和生物反应器中的载体滴度说明，慢病毒载体可高效透过TFDF™膜，EIAV慢病毒载体可完整回收（图9）。
未来方向：灌流模式？
本研究评估了Repligen开发的TFDF™过滤技术，用于从细胞和细胞碎片分离慢病毒载体，作为以批次或灌流模式，进行5L和50L规模收获液澄清的一种方式。结果证实了使用这种有效孔径2-5μm的TFDF™过滤器进行慢病毒载体物料澄清、以用于下游纯化的可行性。澄清单元操作可在1小时内完成，通量范围700-750 LMH，收率一般可达90%以上。基于HIV和EIAV的慢病毒载体，以及对于表达报告基因以及治疗性相关转基因的载体，均可获得相当的结果。
尽管相比标准澄清方法，使用TFDF™进行收获液澄清已可获得高工艺通量和载体产量，但如将TFDF™扩展至以灌流模式进行慢病毒载体生产，可能可进一步显著提高产量。使用HIV-GFP载体，以TFDF™作为细胞截留设备，进行载体颗粒的灌流，可成功进行二次收获，整体工艺产量可提升约80%。
TFDF™技术的设置和操作从技术上看非常简单，通过将TFDF™过滤器、压力传感器、管路和卡箍等整合至单个ProConnex®流路，耗材安装和过滤器运行前准备可在30min内完成。有中空纤维或平板膜包使用经验的操作人员可很快熟练掌握。
总结来说，KrosFlo® TFDF™系统是慢病毒载体收获液澄清的有效工具。工艺效率高、使用简单、可规模放大，且可能可通过对生产罐的重复收获操作提高整体载体产量。
原文：T.Williams, O.Goodyear, L.Davies, et al., Lentiviral vector manufacturing process enhancement utilizing TFDF™ technology. Cell & Gene Therapy Insights, 2020, 6(3):455-467.
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TFDF™ - How it works
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