慢病毒大规模生产的下游工艺
慢病毒载体由于可稳定地将基因整合至分裂和非分裂细胞，而越来越多地被用作基因和细胞治疗工具。虽然慢病毒载体的生产和纯化工艺在过去一段时间来得到了极大的发展，但由于行业对高质量病毒载体需求量的急剧增加，市场仍然面临供不应求的挑战，这也在刺激行业不断开发和优化病毒载体生产策略，从而以一种经济、高效的方式，供应产品。
慢病毒是细胞外生物产物，通过出芽从生产细胞释放。尽管行业现在也在努力向悬浮培养转变，但目前慢病毒大规模生产工艺主要基于以批次模式进行的HEK293或HEK293T贴壁细胞的瞬时转染，收获通常在转染后48-72小时进行一次或两次。收获液的质量高度取决于细胞活性，其会影响收获液中的宿主细胞源性杂质的含量。所以，收获时间的选择不仅需要考虑产量，还需要考虑上清液的质量。
慢病毒生产的下游工艺
HEK293/HEK293T细胞培养生产慢病毒并收获含有病毒的上清液之后，收获液中会含有污染性的杂质，如细胞碎片、质粒DNA、细胞源性蛋白质、生产细胞本身、没有足够效力或安全性的产物异构体以及最主要的污染物 – 血清。下游工艺由一系列的工艺步骤组成，目的是去除所有这些污染物，浓缩收获液体积，同时维持慢病毒活性，而主要挑战是大体积料液的处理以及工艺过程中病毒功能性的损失。为保持载体活性，缩短工艺时间并减少工艺步骤数将是关键。用于小规模浓缩和纯化的方法和工艺单元通常不适用于大规模处理。
慢病毒大规模生产设备的发展已经显著提高了培养表面积，使收获液的体积提到了显著的提升，可达>150L。而对于慢病毒下游工艺，进行大体积料液的浓缩和纯化，且确保在工艺过程中不影响病毒功能特性，是一项极具挑战性的任务。此外，一些纯化-浓缩方法，如离心，不是cGMP规模放大的理想选择，因为在cGMP环境中，以离心方式对含有慢病毒产物的大体积料液进行处理将非常困难，且高速离心可能会破坏慢病毒的囊膜结构，这对于其它含囊膜的病毒载体，亦是如此，如单纯性疱疹病毒或麻疹病毒。下文将介绍行业已经广为采纳的慢病毒载体下游工艺方法，虽然总体目标都是为了获得高质量的慢病毒终产物，但因每个生产商的产品特性和需求的不同，工艺流程会有一定的相似性，又有各自的特殊性。
慢病毒载体大规模生产的一般工艺流程
澄清
病毒载体收获后，需立即进行的第一步是澄清工艺。澄清的目的是去除包装细胞和细胞碎片。小规模的澄清可以通过离心或微滤方式进行，对于大体积料液的处理，需尽量避免离心，倾向于以深层过滤或切向流微滤方式进行。深层过滤是最为常见的澄清方式，用于慢病毒工艺时，一般收率可>70%，且操作简单。使用切向流微滤进行澄清时，可选择孔径0.5μm的膜，经优化后可获得与深层过滤相当或更高的收率。两者的挑战在于，当细胞密度较高，即相应的细胞碎片等杂质含量较高时，会显著影响单位过滤器的处理量或产物透过。Oxford BioMedica最近报导使用Repligen的切向流深层过滤（TFDF）收获和澄清以悬浮培养方式生产的慢病毒，获得了极高的收率（>90%），同时有可能进行多次收获，获得~180%的收率，是传统深层过滤~70%收率的2.5倍。
切向流深层过滤（TFDF）工作原理
浓缩和纯化
切向流过滤
切向流过滤 (TFF) 可在相对较短的时间内降低料液体积并浓缩病毒颗粒，且这种方法可以简单地应用于cGMP生产，是一种适合慢病毒浓缩和大规模上清液处理的理想方法。与传统直流过滤相比，TFF通过料液平行于膜表面循环流动而形成的冲扫作用，可缓解膜污染问题。切向流过滤有两种常见的形式：平板膜包和中空纤维。虽然也有科研机构或生产商使用平板膜包进行慢病毒的工艺处理，但考虑到慢病毒较大的粒径（80-100nm）、囊膜结构以及对剪切的敏感性，一般倾向于使用中空纤维形式，因其内部温和的层流模式，有利于维持病毒的活性。
在慢病毒下游工艺中有多个步骤需要使用切向流过滤，进行料液的浓缩和/或换液(虽然切向流过滤也可以去除部分杂质，如血清蛋白或降解的DNA片段，但在慢病毒工艺中，更多作为浓缩/换液的工具)，包括澄清后、层析前进行浓缩并洗滤换液至适合层析的缓冲液体系，以及层析后的最终浓缩制剂。膜MWCO一般选择500或750kD，但由于步骤需求不同，如在层析后仅为进行浓缩，为避免损失，也可以使用300kD。同时，可通过切向流过滤系统，控制剪切为<4000S-1。经优化后，澄清后、层析前的切向流过滤步骤一般可获得>80%的收率，而层析后步骤收率可>90%。切向流过滤已被用于>100L慢病毒料液的处理。
Spectrum 中空纤维 & KrosFlo 切向流过滤系统
Repligen可提供完整孔径/MWCO、膜表面积规格范围的中空纤维过滤组件以及适用于不同处理量要求的适配切向流过滤系统：
经行业检验且被广泛采用的慢病毒浓缩/洗滤工艺技术
简单实现从工艺开发到临床以及商品化生产的规模放大
完全可抛弃型流路设计，可实现完全封闭式、无菌操作
支持GMP生产的产品质量/法规支持文件以及系统硬件/控制软件
层析
层析是生物大分子纯化的主要技术，由于其可实现快速、高效且可简单重复的纯化，而被广泛用于大规模的纯化操作。根据分离的机制，层析方法可分别多种不同类型。
阴离子交换层析（AEX）是一种可用于慢病毒纯化的高效且经济的工具。这种技术基于慢病毒在中性pH条件下带负电荷的现象。所以，当病毒载体料液通过装填带正电荷的介质的层析柱时，带负电荷的病毒颗粒会结合到介质上，而杂质通过层析柱。AEX已被广泛用于慢病毒的纯化，可获得达70%的良好病毒回收率。但从阴离子交换层析柱上洗脱结合的颗粒，需要将病毒暴露于高盐浓度（0.5 - 1M NaCl），这是这种技术的主要缺点，因为高盐浓度会导致病毒活性的损失。有研究显示，在室温条件下，暴露于1M NaCl 1小时，足以使50%的病毒失活。
亲和层析是另一种纯化技术，其基于目标分子与连接至介质的配基之间高特异性的相互作用，而实现生物分子的分离。这种技术由于其较高的分子选择性，可以帮助减少纯化步骤数。但是，目前还没有可与逆转录病毒或慢病毒囊膜蛋白相互作用的亲和填料的报道。肝素是一种可与不同病毒类型相互作用的、成本较低的亲和配基，包括慢病毒。有报导使用肝素亲和层析进行慢病毒的纯化，获得了53%的病毒载体收率，同时去除了94%的蛋白质杂质和56%的残留DNA。NaCl常用于从肝素层析柱上洗脱载体，但通常要求接近0.5M的盐浓度，即使这个水平的NaCl也可能对纯化病毒将感染的细胞有“毒性”。所以，需要进行额外的精制或纯化步骤，以去除高盐浓度，例如额外进行TFF步骤，以进行缓冲液置换。
在大规模纯化方案中，体积排阻层析（SEC）常被作为精制步骤使用，该方法更适合高效地去除残留的杂质。SEC也称为凝胶过滤层析，是一种相对传统的纯化方法，主要基于病毒颗粒与杂质的粒径差异。过程中没有分子-配基的结合，所以，所有较小的杂质通过层析柱，而较大的病毒颗粒被截留。有报导显示，使用SEC，可获得70%的总逆转录病毒收率以及>90%的纯度。SEC的主要缺点是较难规模放大，因其上样载量较低（10%柱体积）。此外，SEC要求较低的线性流速，这会延长工艺时间。
精制层析的另一种选择是复合模式层析，如Capto Core 700，这种使用流穿模式的层析结合了SEC和AEX的特性，层析介质由具有功能性内核（较大的颗粒不能进入）以及非功能化外层的颗粒组成，有报导显示，使用这种层析方式可获得86%的收率。
OPUS预装层析柱
对于层析步骤，装柱工作需要耗费不少的人力和时间，且需要投入专门的装柱设备，而Repligen的OPUS预装层析柱可帮助药物开发商大大减少这一部分的开支，而将精力集中到工艺相关的工作上来，加快产品的开发。OPUS预装层析柱一个开放式的灵活解决方案，几乎可预装来自任意供应商的任意填料，并可定制柱体积、直径、塔板数和不对称性等柱效参数，且提供可直接用于GMP运行的产品规格，即可实现即取即用，并简单地平台化整合至开发商的工艺流程。
除菌过滤和储存
药物底物的除菌过滤通常使用0.22μm过滤器进行，这是标准的法规要求，但是从载体损失来看，这也是最为关键的步骤之一。有报导称，在大规模下游工艺的这最后一步，损失在30-50%之间。该步骤的回收率取决于所用的膜材质以及慢病毒滴度。研究显示，在最终的浓缩步骤之后进行除菌过滤会导致极低的功能性慢病毒收率。所以，在他们的方案中，除菌过滤在最终的TFF步骤之前，即最终的TFF操作在无菌条件下进行，这也是选择中空纤维过滤器进行TFF操作的原因之一，因为中空纤维与管路、监测元件及容器/料液袋等完整预组装后，经伽马辐照，形成完全封闭式的无菌流路装置。当然，另一种选择是，工艺流程全部在封闭系统中以无菌方式进行，则可以跳过除菌过滤步骤。
Repligen的中空纤维过滤组件提供定制设计、整合管路/容器/监测传感器的预组装、预灭菌流路，即可实现封闭式无菌操作，简化流路搭建的同时，可极大地降低操作风险；此外，对于计划采用全程无菌工艺的产品生产，OPUS预装层析柱亦可定制预辐照灭菌形式。
慢病毒较短的半衰期使得非常有必要在纯化后进行冻存。慢病毒产品通常在-80℃条件下储存，因为还没有有效的制剂方法可以在4℃或室温条件下进行保存。有报导称，感染性颗粒在室温条件下的半衰期为1-2天，在4℃下为8天。但是，-80℃保存，可在1-2年后，仍保留其功能性。储存前，需要将缓冲液置换为最终的冻存保护制剂。有研究称，蔗糖和氯化镁可降低感染性颗粒的损失，提高储存期间的稳定性。尽管如此，当进行大体积产品的冻存时，因为需要较长的冷却时间，仍有部分感染性颗粒过夜失活。
基因治疗2.0：从“基因”到“治疗”
总结
慢病毒的下游工艺并不只有一种正确的策略；可以使用相同的技术，组成形成不同的方案。
为确保最终产品的质量和用于人体时的安全性，必须首先获得GMP认证。多家国际机构发布了一些针对基因治疗的GMP的指南，其考虑了每个生产步骤、原材料、人员、设备等等。而出于对产品质量控制的关注，需要检测一些特定的参数，如检查载体纯度、安全性或效力等等，以确认获得的产物符合监管和应用要求。
参考文献：
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