使用TFDF®技术，优化慢病毒生产经济性
简介
以嵌合抗原受体T细胞 (CAR-T) 为代表的基因和细胞疗法在治疗血红蛋白病、免疫缺陷和癌症方面具有光明的前景。将目的基因递送到特定的靶点，如肿瘤细胞，可使功能恢复或缺陷得到纠正。在最终基因治疗产品的构建中，病毒载体成分起着至关重要的作用。
由于慢病毒在转染分裂和非分裂细胞方面的有效性以及其已建立的安全性，常被选择作为病毒载体。此外，低免疫原性和毒性为基因在转导细胞中的长期表达提供了机会。完全表征化的慢病毒包括人类免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。最近的监管批准为这些以前的学术或科研技术铺平了治疗药物商业化的途径。根据ClinicalTrials.gov临床试验登记数据，使用慢病毒的临床试验数量已从2017年的200项增加到了2020年10月的640项，这是使用率增加的一个重要指标。
然而，支持大规模慢病毒生产所带来的挑战也阻碍其商业化进程。由于难以制备稳定生产细胞系，所以往往需要进行贴壁细胞的瞬时转染。此外，传统的过滤方法，如深层过滤，会形成显著的流体动力应力，对产物质量和产量产生负面影响。生产病毒载体的单元操作是最终生产成本的主要组成部分，这推动了新的强化方法的开发，以通过商业化的经济性，改善患者对产品的可获得性。在日渐成熟的生产技术中，工艺强化在提高生产率和降低成本方面，发挥着关键作用(图1)，以提高候选治疗药物的商业可行性以及商业化治疗药物的潜在市场准入。
来自Repligen Corporation (Repligen) 的切向流深层过滤 (TFDF®)技术将切向流 (TF) 和深层过滤 (DF) 的优点结合到了同一项技术当中，以低剪切的方式，将细胞从培养基中分离出来。当应用于慢病毒生产时，TFDF®技术可以通过强化生物反应器发酵和澄清，来解决多种生产挑战。本应用笔记将介绍从使用深层过滤的补料分批式生物反应器生产现状到采用TFDF®技术的基于灌流的连续工艺的三步进展。在升、批次、剂量和年成本/病人水平上7，评估了工艺产量和经济性。通过使用TFDF®技术，每一步都能进一步提高生产效率。工艺产量的每一次提升，反过来，又都会转化为工艺成本和产品成本的降低 (图1)。
图1. 工艺产量和成本之间的相反关系。通过强化提高工艺产量可降低工艺成本，进而降低产品成本
使用TFDF®技术强化慢病毒工艺
TFDF®技术结合了切向流和深层过滤的优点（前者可处理高细胞密度的样品，后者可有效地透过产物），即在单个技术中，实现高细胞密度样品的高透过。细胞培养进样料液以切向方式流过管状深层过滤器。当进样料液垂直向上通过管腔时，特定大小的组分通过深层过滤器壁，成为滤液。完全流过管式过滤器的进样料液成分直接返回到生物反应器，成为回流液 (图2)。此产品的平均有效孔径范围为2 - 5μm，可透过通常直径为20-100 nm的病毒载体颗粒，即使用TFDF®过滤器，可从宿主细胞和细胞碎片中分离病毒载体。
图2. TFDF®技术结合了切向流和深层过滤的优点，使用高细胞密度的样品时，可有效地透过产物。当使用TFDF®过滤器时，慢病毒在滤液池中回收，而生产细胞截留在生物反应器中
此前的一篇文章介绍了由Repligen和Oxford Biomedica (OXB)合作进行的一项研究的结果，OXB是一家领先的基因和细胞治疗公司。(相关阅读：利用TFDF®技术，强化慢病毒载体生产工艺)。在本研究中，TFDF®技术回收了约90%的产物，而深层过滤在单次收获中仅回收了约70%的产物 (图3)。因此，简单地用TFDF®技术过滤代替深层过滤可以提高20%以上的产量。虽然20%的增长已经很显著，但由于TFDF®技术保留了宿主细胞，所以有可能进一步提高效益。低机械应力可确保截留的细胞保持健康的状态，所以能够具有进一步利用的可能性；在向强化迈进的过程中，单批生产细胞可用于实现多次收获，每次平均收率约为90%。在最初的研究中，作为概念验证，与单次深层过滤收获相比，单批生产细胞收获了两次，总收率提高了250%。在没有技术障碍的情况下，将收获次数扩展到两次以上或发展到连续灌流，两次补料分批收获 (来自同一批次生产细胞)的产量和最终灌流模式下的连续生产将转化为经济收益 (图4)。
图3. TFDF®技术与深层过滤慢病毒工艺产量比较。TFDF®技术过滤器可有效地透过病毒，单次收获的收率约为90% (左起第3柱)，而深层过滤约为70%。采用TFDF® 技术的低剪切细胞截留可保留宿主细胞，通过第二次收获而实现强化，不需要解冻新的细胞库并通过种子扩增进行扩增(左起第4柱)。与深层过滤的单次收获相比，TFDF®技术在两次收获中实现了250%的总收率增长 (左起第5柱)。
图4. 从深层过滤进展到基于灌流的连续工艺。标准深层过滤收获工艺 (1)，TFDF® 单次收获(2)，TFDF®多次收获，第一步强化(3)和连续灌流强化(4)。
慢病毒生产成本建模
从Oxford Biomedica的研究所获得的数据被用来对四种不同的生产方案进行建模。在该模型中，慢病毒转导自体CD34+造血干细胞(HSC)，这是一种治疗遗传性免疫缺陷的已建立方法。使用1x10^10慢病毒转导单位(TU)/剂的值，该模型只包括主要耗材，并使用已确定的工艺参数构建 (表1)。
表1. 用于建模四种不同生产方案的工艺参数和耗材成本
生物反应器 | |
工艺 | 以1μg 质粒DNA/1E6悬浮细胞进行转染 |
病毒产率为5 TU/cell/day | |
25%澄清后收率 | |
澄清后单元操作：超滤/洗滤(UF/DF)、层析、除菌过滤、制剂/灌装 | |
耗材成本 | GMP级质粒DNA：$300,000/g |
悬浮细胞培养基：$100/L | |
过滤器(深层过滤、无菌TFDF®、UF/DF)：$5,000/m2 | |
层析介质：$5,000/L |
未经优化的下游可导致低收率
对于考量的四种生产工艺，细胞收获或截留收率均基于参考的Repligen- Oxford Biomedica文章的结果(表2)。两次收获的TFDF®技术工艺包括在第一次收获后用新鲜培养基补充生物反应器。对于灌流工艺，在转染前后，使用TFDF®技术过滤器作为细胞截留装置并运行连续收获。
表2. 用于建模四种不同慢病毒生产工艺的经济性的参数
批次 – 深层过滤 (1次收获) | 批次 – TFDF® (1次收获) | 批次 – TFDF® (2次收获) | 灌流 – TFDF® (连续收获) | |
细胞培养模式 | 批次 | 批次 | 批次 | 灌流 |
种子扩增生物反应器 (L) | 200/500 | 200/500 | 200/500 | 20/50 |
生产生物反应器体积 (L) | 2000 | 2000 | 2000 | 200 |
活细胞密度 (cells/mL) | 2x106 | 2x106 | 2x106 | 2x107 |
病毒生产阶段 (天) | 2 | 2 | 3.5 | 3.5 |
过滤技术 | 深层 | TFDF® | TFDF® | TFDF® |
收获/截留收率 (%) | 70 | 90 | 90 | 90 |
使用TFDF®技术，收获剂数可提高达20倍
工艺经济性首先通过考虑每升生物反应器获得的剂数进行分析。利用表1中的参数，计算了预期截留率和可能的病毒基因组总数(VG)/批。将深层过滤工艺定义为1级产量，结果表明，潜在的产量可增加1.29至22.50倍。简单地用TFDF®技术替代深层过滤，产量提高了1.29倍 (表3，图5)。TFDF®技术的切向流部分功能因其低滞留体积特性，在创造1.29倍的产量方面发挥了关键作用。由于进样料液连续通过深层过滤器，产物不会被滞留在死端污染的过滤器中而损失。当对单元操作进行强化，使用TFDF®技术截留细胞，以进行额外的收获时，产量可显著提高1.29倍以上。扩展超过单次收获可以通过多种模式完成。在多次收获模式中，在补料分批模式中，收获在离散的时间点开始和完成。多次收获的执行非常简单，因为它几乎在每个方面都类似于标准的补料分批收获。工艺本身定义了每次收获，产物质量分析可以用来指导是否将每次收获合并或不合并的决策。从补料分批模式过渡到灌流模式，真正最大化了使用TFDF®进行生产细胞截留的好处。灌流可使细胞密度增加10倍，使生物反应器规模降低10倍，使总产量/L提高达22.50倍。因此，如果深层过滤产生0.35剂 /L，则TFDF® 技术在灌流模式下可生产7.9剂/L。
表3. 使用深层过滤、TFDF® 技术补料分批和TFDF® 灌流工艺进行生产时，每L生物反应器获得剂数的比较性评估
批次 – 深层过滤 (1次收获) | 批次 – TFDF® (1次收获) | 批次 – TFDF® (2次收获) | 灌流 – TFDF® (连续收获) | |
总VG/批次 | 7.0 x 1012 | 9.0 x 1012 | 15.8 x 1012 | 15.8 x 1012 |
剂数/批次 | 702 | 903 | 1581 | 1581 |
剂数/L 生物反应器 | 0.35 | 0.45 | 0.79 | 7.9 |
图5. 与深层过滤相比，将TFDF® 技术应用于三种不同模式时的倍数增加。相对于深层过滤，TFDF®技术可将生产的剂数增加1.29至22.5倍。用TFDF®过滤代替深层过滤，可使产量提高1.29倍。从相同的生产单元中进行2次收获可以增加2.25倍的产量。转换为连续收获的灌流模式，产量增加22.5倍。
使用TFDF®技术，耗材成本可降低达60%
采用TFDF®技术的慢病毒工艺强化提高了产量，降低了所需耗材的成本。再次使用剂/L作为度量标准，计算了TFDF®过滤和深层过滤工艺的耗材成本 (表4，图6)。
作为基准，耗材成本/剂约为$2,500/剂，表明其对病毒载体总成本的重大影响。用TFDF®技术替代深层过滤，单次收获的剂数增加了1.29倍/批，继而降低了耗材成本/剂。使用TFDF® 技术时的耗材成本下降了21%，至$1,946/剂。两种收获方案的产量提高了2.25倍，进一步使成本降低了45%，达到$1,367/剂。最后，在灌流模式下运行TFDF®技术可使成本降低60%，至$988/剂。
表4. 使用深层过滤、TFDF® 技术补料分批和TFDF® 灌流工艺进行生产时，耗材成本的比较性评估
批次 – 深层过滤 (1次收获) | 批次 – TFDF® (1次收获) | 批次 – TFDF® (2次收获) | 灌流 – TFDF® (连续收获) | |
剂数/批次 | 702 | 903 | 1581 | 1581 |
耗材成本/剂 ($) | $2,471 | $1,946 | $1,367 | $988 |
相比深层过滤，耗材成本/剂 (%) | 100% | 79% | 55% | 40% |
图6. 慢病毒生产成本分析，每种方案所需的耗材成本/剂。使用TFDF®技术进行1次收获、2次收获和灌流模式的耗材成本分别为深层过滤所需耗材成本的79%、55%和40%
通过考虑总体的患者需求，可以获得更全面的耗材成本分析。需要1剂/年的患者数量并不总是能被生产的剂数/批次整除，因此最终值对确切的患者数量有一定的依赖性；如果一个批次的每一剂都被使用，那么成本/患者比如果一个批次的大部分都没有被使用要低。这种复杂性水平被引入到模型中，因为规模放大是一个严格控制的过程，即使有，也很少允许部分批次响应市场需求。
根据每种生产工艺方案的产量，估计治疗5000名患者/年需要的批次数量，并用于计算耗材成本/年 (表5，图6)。为了满足5000名患者/年的需求，深层过滤需要8个批次，平均批次成本为$173万，年成本为$1,382万。使用TFDF®技术，以1次收获方式进行澄清，可使批次数减少2到6批，平均批次成本与深层过滤相当，为$176万，年成本可降低至$1,054万。使用TFDF®技术以多次收获模式进行2次收获，可将批次数减少到4批。有趣的是，使用TFDF®技术进行2次收获会将每批成本适度增加至$216万，但每年的成本可显著降低至$862万。正如预期的那样，从批次到灌流的转换提供了最有利的经济效益，批次成本为$156万，年成本仅为$625万。因此，无论是单次收获批次、两次收获批次还是灌流模式，TFDF®技术都可提供更优化的整体生产经济性，分别为深层过滤的76%、62%和45%。在这个模拟使用案例中，从使用深层过滤进行澄清收获的补料分批工艺过渡到使用TFDF®技术的灌流工艺，每年可减少成本$758万。如果患者数量从每年5,000人增加到10,000人，甚至15,000人，那么经济效益就会增加两倍和三倍(图6)。
表5. 使用深层过滤、TFDF® 技术补料分批和TFDF® 灌流工艺进行生产时，满足需求/患者/年所需成本的比较性评估
批次 – 深层过滤 (1次收获) | 批次 – TFDF® (1次收获) | 批次 – TFDF® (2次收获) | 灌流 – TFDF® (连续收获) | |
剂数/批次 | 702 | 903 | 1581 | 1581 |
患者数/年 | 5000 | |||
批次/年 | 8 | 6 | 4 | 4 |
成本/批次($百万) | 1.73 | 1.76 | 2.16 | 1.56 |
成本($百万)/年 | 13.82 | 10.54 | 8.62 | 6.25 |
相对成本（%深层过滤） | 100% | 76% | 62% | 45% |
总结
基因和细胞疗法在解决未被满足的医疗需求方面有着令人惊奇的希望。更传统的治疗药物，如小分子、重组蛋白和单克隆抗体，从发现到开发阶段通常需要数年的时间。然而，在确定了治疗药物形式之后，此前数十年的生产技术发展为这些传统药物配备了经济上可行且可放大的平台。相反，基因和细胞治疗的早期开发可以迅速进行，可能就在几个月内，而经济上可行且可放大的生产平台则是一个重大阻碍。TFDF®技术通过提高单位体积产量、简化收获单元操作和改善整体工艺经济性，可帮助克服生产产量挑战。之前的工作证明了HEK293细胞与TFDF®技术过滤的相容性，无论是单次收获模式还是多次收获模式。这里，我们对TFDF®从补料分批到灌流的扩展进行了建模，并估计了每升产量的提高以及优化的每年经济效益。TFDF®技术在所有三种方案中都可提高产量和经济性。在所有三种方案中都能观察到好处，这一事实发挥了关键作用。人们可以选择快速实施该技术，作为单次补料分批收获单元操作，然后逐步建立灌流，实现产量提升和经济效益。
参考文献
Papanikolaou E. and Bosio A., The promise and the hope of gene therapy. Frontiers in Genome Editing. 2021; 24(3):4. Lana M.G. and Strauss B.E., Production of lentivirus for the establishment of CAR-T cells. Methods Mol Biol. 2020; 2086:61-67. Clinical Trials.govDatabase. Search: Clinical Trials Using Lentiviral Vectors. McCarron A. et al., Challenges of up-scaling lentivirus production and process. J. Biotechnol. 2016; 240:23-30. Moss D. Vector purification: issues and challenges with currently available technologies. Cell Gene Ther. Ins. 2019; 5(9): 1125–32. Raghavan B. et al. Optimizing the clarification of industrial scale viral vector culture for gene therapy. Cell Gene Ther. Ins. 2019; 5(9): 1311–22. Williams T. et al., Lentiviral vector manufacturing process enhancement utilizing TFDF™ technology,Cell & Gene Therapy Insights 2020; 6(3), 455–467.
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