加速生产，在100天内大规模供应新型腺病毒载体疫苗
来自牛津大学等的研究人员在2021年12月的《bioRxiv》上发表了题为“Accelerating manufacturing to enable large-scale supply of a new adenovirus-vectored vaccine within 100 days”的文章。文中，研究人员介绍了优化腺病毒载体生产、以实现快速大流行响应的工作，其方法是尽可能降低临床试验和首次大规模供应的时间，并推动现有生产足迹的产出最大化。文章介绍一种快速病毒种子扩增工作流程，其允许在抗原序列鉴定后60天内将疫苗推进到临床试验，然后再在40天内从分布于全球的站点生产疫苗。同时，研究人员介绍一种新的、基于灌流的上游生产工艺，旨在实现产量的最大化，同时保持现有生产工厂的简单性和适用性。这将ChAdOx1 nCoV-19上游工艺的单位体积生产率提高了约4倍，并保持与现有下游工艺的兼容性，每升生物反应器体积产生足够10,000剂的药物底物。
研究人员指出，在大型生产网络中过渡到新的生产工艺是一项重大任务。在短期内，快速种子制备工作流可用于现有的生产工艺。作者还利用技术-经济模型表明，如果实现线性放大，一个包含两个2,000L生物反应器的工厂运行开发的新灌流工艺，每月可供应约1.2亿剂药物底物，成本<0.20欧元/剂。研究人员估计，如果有适当的事先准备和资源，包括足够的灌装能力，一个具有3.2万升生物反应器产能的生产网络，可在对一种新病原体进行基因组测序后的130天内，放行大约10亿剂新疫苗。这种加速的生产过程，以及热稳定性等其它优势，支持了腺病毒载体疫苗作为快速适应且可部署的应急响应平台的持续价值。
本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
实验操作
详细实验材料和方法，请参考原文
高通量灌流研究
对于工艺条件的高通量筛选，实验使用多级并联生物反应器和灌流系统Ambr® 250HT Perfusion结合0.2μm中空纤维过滤器以ATF模式进行。详细操作条件、实验设计和数据分析，请参考原文。
规模缩小生产生物反应器
实验设计了灌流过滤器的尺寸和流速参数，使用Repligen XCell Lab技术，提供2,000L生产规模的精确3 L规模缩小模型。0.022 m2过滤器 (ATF1，Repligen) 以5 L/m2/min的交替式切向流进行操作，以3 L/day (0.11L/m2/min) 置换培养基，剪切率 (1516 s-1)和其它流体动力学参数类似于2000 L生物反应器（工作体积1500L）使用11 m2过滤器(ATF10，Repligen)在推荐条件下进行灌流的参数。这些流速值在常用的操作范围内。
配有开放式管道、倾斜叶片叶轮和光学pH端口的BioBLU 3c一次性生物反应器用于带有集成智能传感器管理(Mettler Toledo)的BioFLo320并联生物反应器系统 (Eppendorf)。将浸没的添加管路焊接到XCell ATF 1一次性中空纤维过滤器和泵装置(Repligen)的生物反应器连接管路上，中空纤维孔径 0.2 μm、内径1 mm、表面积218 cm2。使用XCell Lab 控制器(Repligen) 将交替式切向流速设置为0.11 L/min (5 L/m2/min)。通过BioFlo320集成泵控制滤液(耗竭的培养基)和添加新培养基的流速，达到期望的培养基置换速率。新培养基补液泵由一个编程的重量反馈回路控制，以保持恒定的反应器重量。
培养基和生物反应器参数以及病毒感染操作设置，请参考原文。
下游工艺主要包括深层过滤澄清、阴离子交换层析纯化以及切向流过滤制剂和0.2μm除菌过滤。实验中，澄清的裂解液使用KrosFlo KR2i系统（Repligen）和Pellicon 2 平板膜包（300kD、0.1m2、C型筛网）以切向流过滤进行浓缩，流速设置为5 L/min/m2。实验中通过KRJr滤液控制泵（Repligen）将滤液速度控制为0.66 L/min/m2，进样压力通过回流管路上的自动背压控制阀控制为0.7 bar，此外，通过控制工艺容器的重量，使洗滤缓冲液补加速度与滤液流速匹配。2倍浓缩后，回流液以离子交换漂洗缓冲液进行1洗滤体积的洗滤。之后，料液以离子交换层析进行纯化，洗脱缓冲液再以不含PS80的制剂缓冲液进行6 DV置换。最终的切向流过滤使用如上系统和膜包进行，进样流速5 L/min/m2，进样压力0.7 bar，滤液流速0.66 L/min/m2。添加PS80至浓度0.1% v/v，产品以0.2 μm过滤器过滤。
质量分析和技术-经济建模，请参考原文。
结果和讨论
详细实验结果和分析，请参考原文
基于灌流的优化上游工艺
实验在3 L一次性生物反应器中，在三个独立的精确生产模拟运行中，测试了一种新的上游工艺，使用ATF进行培养基置换。实验条件与多平行实验中简化中心点型生物反应器相似，灌流开始早，但未强化。从感染前48小时开始，每天灌流1个罐体积，活细胞密度约为3× 10^6 cells/mL，在三次试验中，感染时活细胞密度为6.5-7.0× 10^6 cells/mL。活细胞密度在1× 10^7 cells/mL左右达到峰值，在病毒复制过程中，活细胞密度如预期下降。
从感染当天开始，葡萄糖浓度下降，乳酸浓度上升。从感染的当天开始，碳酸氢盐的添加率不断增加， pH值持续小幅下降，而氨和二氧化碳水平几乎没有变化。ATF过滤器跨膜压在整个灌流过程中稳定在-0.8- -0.9 bar之间，表明膜没有明显的污染。
在三次生产模拟运行中，下游工艺前的单位体积生产率为1.4-1.6× 10^12 VP/mL，细胞特异性生产率为1.5-1.6 × 10^5 VP/cell。
基于灌流的优化上游工艺的生产率和性能(C.Joe, et al., 2021)
在3次独立规模缩小生产运行中，基于灌流的上游工艺的性能(C.Joe, et al., 2021)
三次独立生产运行的数据；CJ74为黑色，CJ78为红色，CJ87为蓝色。通过ATF灌流进行培养基置换开始于感染前2天，每天1个罐体积，并持续到感染后2天，然后收获生物反应器。(a) 活细胞密度和细胞活性。(b)葡萄糖和乳酸浓度。(c)pH值和碳酸氢盐加入速率。(d)氨浓度和二氧化碳分压。
技术-经济建模
接下来，研究人员利用Biosolve软件构建了一个技术-经济模型，该模型基于之前的小规模实验数据和2,000 L补料分批工艺模型，以估算基于2,000 L灌流工艺的成本、耗材和设备需求。
文章研究了种子扩增、生产生物反应器和下游工艺链的两种使用方案。第一个场景包含一个种子扩增链，最终形成一个200L的非灌流“n-1”反应器，一个2,000 L的生产反应器以及下游工艺链。这需要生产罐的缓慢轮转 (大约10天的循环时间，包括7天的细胞扩增，2天的感染，1天的清洗/准备)，因此下游工艺链的利用率很低。在第二个方案中，将一个200 L灌流“n-1”反应器添加到种子扩增链中 (减少了生产生物反应器中细胞扩增的持续时间)，并用于服务两个2,000 L生产生物反应器。这种方法将大约每4天为下游工艺提供一批料液。通过将种子链和纯化链的利用率提高一倍以上，这种方法可以使车间的产量增加一倍以上，同时所需的占地面积只小幅增加。对下游工艺的建模表明，通过对补料分批工艺中使用的设备进行适度调整，可以在典型现有设备的能力范围内执行该工艺。
假设工厂利用率为70%，预计一座这样的工厂每年能够生产大约12亿剂，商品成本低于0.20欧元/剂。在针对紧急响应的短期产能最大化操作的假设下，我们估计8座这样的工厂 (即安装的生物反应器总产能为32,000L)每月可提供总计10亿剂。
灌流工艺的技术–经济建模
安装2 x 2,000 L灌流生物反应器的洁净室中的设备、产品和物料流。
工产日程安排示意图，显示使用单个细胞种子扩增链、两个生产生物反应器和单个下游纯化链。该日程安排每3.5天提供一批；而文中工厂输出的计算假设为一个更保守的4天循环时间。
讨论
SARS-CoV-2基因组序列是2020年1月10日公布的。腺病毒载体疫苗ChAdOx1 nCoV-19在104天后（2020年4月23日）给药给第一个临床试验志愿者，在360天后（2021年1月4日）首次临床试验外给药。566天（2021年7月29日）后宣布放行第10亿剂。大约在同一时间，第一个mRNA疫苗(来自辉瑞)和灭活SARS-CoV-2疫苗(来自科兴生物)放行了第10亿剂疫苗。领先COVID-19疫苗实现上述每一个里程碑的进展速度大大快于以往任何新疫苗。研究人员现在估计，如果我们目前的知识在SARS-CoV-2序列公布时就能立即获得，并按照此处所述的方式生产，那么在2020年5月底之前的一年多时间里，就可以获得10亿剂疫苗。
在疫苗开始大规模供应之后，达到产量里程碑(如第10亿剂)的时间是受资源(如生产工厂占地面积m2)和以每天、每m2剂数为单位的产量的影响。后者是单位体积生产率和循环时间的共同结果。这里介绍的、用于ChAdOx1 nCoV-19生产、基于灌流的上游工艺，与此前工艺相比，单位体积生产率可提高约4倍 (每升生物反应器培养可获得约8 × 10^14 VP的纯化药物底物，足以生产>10,000剂DP)。
研究在Ambr 250 HT灌流系统上的“实验设计”方法基础上确定了及早灌流启动和感染后强化灌流是提高单位体积生产率的因素。然后，在3 L系统中设计了一种新的、基于灌流的上游工艺，其中包括及早灌流启动，但没有感染后强化灌流。在这项工作中，实验证实了该工艺的可重复性能，从感染前48小时到感染后48小时，使用恒定的灌流速率 (1 VVD)。该研究没有进行强化灌流的原因是，生产ChAdOx1 nCoV-19的工厂能够每天处理1个罐体积的培养基 (作为当前工艺的要求)，但可能无法每天处理强化的2个罐体积料液。上游生产率的大幅提升与现有的下游工艺兼容，实验证明产品回收率 (约50%)和产品质量符合预期。
分析使用了一个技术-经济模型来考量设备/设施需求和运行设计，以实现该工艺的高产量(每天、每m2 剂数)。结果估计，容纳两个2,000 L生产生物反应器的单座工厂可以实现每月约1.2亿剂的短期产量。研究人员相信，现有的许多工厂 (包括位于低、中等收入国家的一些工厂)将适合这一需求。每剂药物底物的成本预计将是目前补料分批工艺的一半左右。基于小规模工艺的线性放大进行预测虽然存在不确定性，但实验中的3 L工艺是精心设计的，可作为2,000 L规模生产的精确规模缩小模型，我们和其他团队之前在类似工艺的放大中取得了成功，这里的下游工艺和已经在使用的工艺基本上没有什么变化。
总的来说，这项工作表明腺病毒载体疫苗平台适合实现“100天'登月'目标”，而且在撰写本文时，已经对生产工艺的生产率进行了相当大的改进。我们认为，在试验规模和大规模供应的时间以及实现给定产量水平所需的工厂占地方面，仍有进一步改进的空间。然而，本文所述的方法可能足以减少与其它平台相比的生产速度和工厂产量方面的差异，使其它因素在考虑不同平台在应急响应中的持续作用时变得更加重要，此类考量包括安全性、耐受性、有效性、稳定性、成本、规划的适宜性、个体接种者的偏好，以及生产商支持技术转移出其自身工厂的意愿等等。就这些因素而言，腺病毒平台目前具有独特的优势，可与其它方案互补，在某些情况下可根据特定背景而定。腺病毒载体疫苗的重要和持续优势是：全球生产设施网络的存在、良好的安全性、实现单剂保护持续数月的能力，以及液体制剂在2-8°C下≥6个月的稳定性使其易于分发。
原文：C.C.D.Joe, R.R.Segireddy, C.Oliveira, et al., Accelerating manufacturing to enable large-scale supply of a new adenovirus-vectored vaccine within 100 days. bioRxiv,2021, doi: https://doi.org/10.1101/2021.12.22.473478.
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