基于电容探针-CSPR控制的N-1灌流平台开发
来自百时美施贵宝（BMS）的研究人员在2022年第9期的《Bioengineering》杂志上发表了题为“N-1 Perfusion Platform Development Using a Capacitance Probe for Biomanufacturing”文章。文中，研究人员指出，通过在生物生产的 N-1 阶段实施灌流操作，可以在以中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞生产单克隆抗体 (mAb)时实现补料分批工艺的强化，从而显著缩短培养持续时间或获得更高的滴度。相比传统N-1批次种子制备，具有更高最终活细胞密度（VCD）的N-1 灌流种子可用于显著提高后续补料分批生产（N 阶段）的接种 VCD，从而实现更短的细胞生长期、更高的峰VCD或更高的滴度。而在最新的研究中，其将过程分析技术 (PAT) 工具整合到 N-1 灌流平台中，使用在线电容探针，根据实时VCD 测量值自动调整灌流速率。在所有测试的细胞密度（最高达130 × 10^6 cells/mL）下，电容测量值与离线 VCD 呈线性相关。与基于体积特异性灌流速率的方法相比，通过细胞特异性灌流速率(CSPR) 在线控制灌流速率可将培养基使用量降低约25%，并且不会对细胞生长产生任何不利影响。研究人员将此PAT 工具应用于6种 mAb，并选择了0.04 nL/cell/day的平台CSPR，可使6种细胞系中的4种快速生长并维持高活性。此外，小规模电容数据被用于中试工厂和GMP 生产车间中的 N-1 灌流工艺的规模放大。实施基于电容测量的平台方法来控制灌流速率可促进灌流 N-1工艺的有效开发，支持高密度 CHO 细胞培养，实现补料分批工艺强化。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
尽管生物制药行业对连续上游生产工艺非常感兴趣，但目前补料分批工艺仍然是稳定蛋白质（如单克隆抗体(mAb)）的主流生产模式。传统补料分批工艺通常以<1 x 10^6 cells/mL 的初始活细胞密度(VCD) 进行接种。通过以更高的初始 VCD（如2 - 8 x 10^6 cells/mL）接种生产生物反应器，可以提高补料分批工艺的单位体积生产率和产量，缩短初始生长期和总培养时间。而进一步提高初始VCD（例如，10 - 20 x 10^6 cells/mL）可以使补料分批细胞培养滴度加倍，这与当前文献中报道的最佳滴度的高值相当。
以更高的初始 VCD 接种生产生物反应器需要 N-1 达到更高的最终VCD（例如，14 - 30 x 10^6 cells/mL），这可以通过N-1灌流强化策略来实现，其已被证明可实现高于 60 - 100 x 10^6 cells/mL的最终高VCD，而使生产生物反应器的接种 VCD 高于 10 x 10^6 cells/mL。由于补料分批工艺强化可以通过 N-1 灌流实现极大的滴度提升或缩短培养时间，同时与传统补料分批相比，可维持成本效益（总培养基USD/g mAb），因此在细胞培养领域，N-1 灌流策略已被广泛用于 mAb 生产。
在灌流培养中，控制灌流速率的一种常用方法是以固定体积灌流，其以预定速率随时间进行调整，通常标准化为生物反应器工作体积，即每日罐体积(VVD)。这种体积特异性的置换率策略在实施中相对简单，但为了避免细胞因为灌流体积过低而导致缺乏所需的营养物质，这种策略往往会灌流高于细胞维持健康状态所需的培养基。在灌流工艺的规模放大过程中，过量培养基的灌流会造成不小的挑战，包括大体积培养基的制备和储存。这个问题的一个解决方案是基于细胞量调整灌流速率，细胞特异性灌流速率(CSPR) 描述了在每个细胞基础上提供给培养体系所需的新鲜培养基量以及通过细胞截留装置灌流去除的等量耗竭培养基。
基于 CSPR 的灌流策略在概念上可以为细胞培养提供支持在所有 VCD条件下细胞生长所需的精确培养基量，控制成本，同时提高与灌流工艺相关的生产力。然而，与细胞生长的时间尺度相比，典型VCD 测量的时间尺度（如每天一次）频率太低了，尤其是在高细胞密度下，对数扩增的细胞培养可以在数小时内显著增长。相比之下，过程分析技术(PAT) 工具可以实时或接近实时地测量关键过程参数，例如VCD。在使用 PAT 实时测量 CHO 细胞培养VCD 的最常见选项中，电容探针在灌流细胞培养应用中特别受关注，其可提供非破坏性、快速、实时测量，在高细胞密度条件下也可准确检测VCD，并且是一种与 GMP 兼容的技术，已报导用于制药应用。
研究旨在 N-1 灌流生物反应器中使用在线电容探针，根据实时 VCD 测量准确地提供和控制灌流速率，并将其开发为一种平台化方法，即不仅仅是技术的成功概念验证，还需要证明结论对许多CHO 克隆的适用性，以建立对该策略适用于未来分子的信心。一个高效的细胞培养平台将定义一组起始细胞培养条件，其适用于大多数产品，并包括一个开发工作流程，通过该流程可以有效地优化工艺，以提高工艺性能或稳健性。
该研究团队在之前的报告中介绍了其生产平台从传统工艺到强化工艺的演变，并证明提高接种密度，再加上培养基优化，可以提高生产生物反应器阶段的滴度（参见文末相关阅读）。本报告以之前的报告为基础，重点关注N-1 阶段的优化，以提高在生产阶段使用的接种密度。具体来说，其证明电容探针可以很好地检测6种不同 mAb 分子的VCD，可作为工艺开发的起点，并且与基于体积的策略相比，可以减少培养基使用。电容控制的灌流可以在几个实验内快速优化，以实现高效的N-1 灌流工艺开发，且可成功地规模放大。最后，如果出于生产工厂适配性需要，可基于前期数据而转换回基于体积的灌流策略，从而在多个生产工厂中灵活使用这些工艺。
详细实验操作和结果，请参考原文。
使用在线电容控制的实验室规模N-1灌流生物反应器
带有 Finesse DeltaV 控制器的实验室规模 5 L 台式玻璃搅拌罐生物反应器（Sartorius UniVessel）配备交替式切向流（ATF）XCell ATF®2 灌流装置（Repligen）和 Incyte 电容探针（Hamilton）。生物反应器配备 CO2 鼓泡，以控制pH 值。溶氧设定点为 40%；生物反应器同时使用钻孔鼓泡和微泡来维持该设定点。根据细胞密度将搅拌设置为 260 至 320 rpm，因为较高的细胞密度通常需要较高的搅拌速率来维持40% 的 O2 饱和度。根据需要使用消泡剂 C（SAFC，Sigma Millipore；3000ppm）来控制生物反应器中的泡沫水平。反应器的工作体积设置在3.0 到 4.0 L 之间。灌流 N-1 工艺的持续时间在 5到 7 天之间调整，具体取决于 mAb 和所需的最终VCD。
使用 Repligen 的 XCell ATF® 2 灌流过滤系统在接种后一天开始灌流。ATF2 过滤器为聚醚砜纤维化学材质，孔径0.2 µm，最近有报道称其是减少膜柱堵塞的最佳选择。灌流要么以特定体积置换率运行，要么使用电容探针收集的在线测量值来控制在0.02 和 0.12 nL/cell/day之间的固定 CSPR。灌流速率计算如下：
ATF 置换率为0.8 - 0.9 L/min，滞留时间计算为 60 s。通过C24 ATF 控制器向 ATF 提供交替加压和排气循环。通过向灌流液泵施加以ml/min为单位的灌流速率（体积比或通过电容探针控制）并根据需要将新鲜培养基泵入生物反应器，以使用反应器重量保持设定工作体积，从而维持固定的工作体积。体积特异性置换率指的是离线、预定义的每天罐体积 (VVD) 灌流策略。
在线电容探针灌流 N-1 控制策略的示意图。(A) 电容探头。(B) 电容/DeltaV 控制器，灌流速率计算，Dperf，基于 CSPR 和VCD。(C) 灌流液泵，驱动灌流速率，Dperf。(D) 培养基补液泵，由生物反应器天平重量反馈控制。(E)生物反应器天平。(F) ATF 控制器，控制 ATF 循环速率。
报告为介电常数 (pF/cm) 的在线电容测量值通过电容校正因子常数与离线 VCD 测量值相关联。在绘制介电常数 (pF/cm) 与 VCD (×10^6 cells/mL)的图时，使用最佳拟合线的斜率确定每种 mAb 的常数。电容测量模式设置为 1 MHz。
测量的介电常数与离线测量的VCD的相关性。对于多种mAb，从相对较低的细胞密度到高细胞密度（高于100 × 10^6 cells/mL），介电常数可与离线VCD相关联，且具有高准确性。从而即使在高密度条件下，也可以用于控制灌流速率，以及随后生产生物反应器10- 20 × 10^6 cells/mL 的接种。
对于以体积特异性灌流置换率和在线CSPR控制的N-1灌流运行的VCD、活性以及累积灌流的培养基量。与基于体积的灌流控制选项相比，细胞特异性自动灌流控制策略能够显著降低培养基使用量。
N-1规模放大实验
对于特定 mAb，实验室规模工艺在中试工厂放大到 200 L 和/或在GMP 生产设施中放大到 500 L。200 和500 L N-1 生物反应器使用一次性细胞培养袋 (Cytiva)。200 和500 L 生物反应器使用 XCell ATF® 6，并以 17.3 L/min 的ATF 置换速率运行。根据经验证据和过去的项目经验确定规模放大后的搅拌速度。200和 500 L 的搅拌速度分别约为 120 和110 rpm。根据 5 L 规模的单位体积气流速率 (VVM) 匹配通气参数。200 L 反应器的工作体积设置为 80 - 85 L，500 L 反应器的工作体积设置为190 L - 215 L。
以电容探针控制的N-1灌流生物反应器的规模放大性能。比较在不同生物反应器规模条件下的细胞培养性能。证实该技术具有可放大性，对于mAb4 和 mAb5，可在GMP 生产环境中实施。
总结
总结来说，研究证实了在针对多种mAb的强化 N-1 灌流平台工艺中可集成在线电容探针。介电常数被证明与VCD 具有很强的相关性，即使在高细胞密度条件下，在线电容探针的应用使N-1 工艺开发更高效、更快。与基于体积的灌流策略相比，培养基使用量减少了约25%，并且通过使用 CSPR 作为单个变量来简化平台开发工作流程，该变量在生长速率发生变化时用于调整灌流速率（例如，考虑到克隆之间的差异或工艺参数的差异）。该技术已实现了多次成功的大规模N-1 灌流运行，包括在 GMP 生产环境中。
原文：E.S.C.Rittershaus, M.S..Rehmann, J.Xu, et al., N-1 Perfusion Platform Development Using a Capacitance Probe for Biomanufacturing. Bioengineering, 2022, 9(4), 128.
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