使用N-1种子罐灌流，开发强化补料分批生产平台，获得翻倍滴度
来自美国百时美施贵宝公司的研究人员在2020年第7期的《Bioresources and Bioprocessing》杂志上发表了题为“Development of an intensified fed‑batch production platform with doubled titers using N‑1 perfusion seed for cell culture manufacturing”的文章。文中，研究人员指出，细胞培养工艺强化的目标是提高单位体积产量，其通常通过提高生产中的活细胞密度（VCD）、细胞特异性产率或生产生物反应器的使用来实现。在之前的研究中，研究人员已通过将接种密度从~0.6x10^6 cells/mL（工艺A）提高到3-6x10^6 cells/mL（工艺B），并结合培养基富集，证实了更高滴度或更短运行时间的补料分批生产工艺强化。在本研究中，研究人员使用N-1种子罐灌流培养，将接种密度进一步提高到了10-20x10^6 cells/mL（工艺C），并应用于4种不同的产mAb CHO细胞系，在10-14天的生物反应器运行时间中，滴度可在原工业相关水平上提高100%。重新设计的基础和补液培养基促进了在整个生产运行中更高VCD和细胞特异性产率的维持，而培养基富集、补液策略以及温度调节优化对于适应高VCD状态也至关重要。强化的工艺C成功规模放大到了500L生物反应器，质量属性与相应的1000L规模工艺A和工艺B相当。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
单克隆抗体（mAb）产品的开发已经获得了极大的成功，目前已有80多个mAb产品获得了上市许可，此外，还有超570个处于不同临床开发阶段的mAb管线。2018年，mAb全球年销售额超$115B，预计2025年将超$300B。但尽管mAb工艺开发已经取得了极大的发展，mAb的生产成本仍远高于小分子。为了让更多的患者用得上药，降低供应短缺，并与生物仿制药竞争，降低mAb生产成本是一个不小的挑战。
当前的补料分批 mAb生产平台虽然已经相对稳定，但也不算完全成熟。从上世纪80年代到最近十年，通过细胞系工程优化、培养基开发以及工艺控制水平的提升，已经可达到更高的细胞特异性产率、提高峰VCD并延长高产率持续时间，生产滴度已经从几十mg/L提高到了≥3 g/L。从最近的报道来看，滴度还将继续提高（如在14-18天内，达到9-10 g/L），说明补料分批操作还有潜力进一步提高产率、降低成本。
为进一步提高单位体积产量，很多公司在寻求工艺强化，这在化工行业已经使用了几十年，其通过连续操作模式，提高工艺产量、增加产品价值并降低工厂占地。在强化的上游细胞培养工艺中，提高单位体积产量的三个主要参数是提高活细胞密度、增强细胞特异性产率以及提高生产生物反应器的利用（包括降低非生产性生物反应器的周转期，以及降低低产率细胞生长期和生产后期）。使用灌流的连续细胞培养已经在生物工艺中成功使用，主要用于生产细胞或病毒，以往常以低滴度或不稳定蛋白质及酶作为目的产物。但是，在整个行业的商业化哺乳动物细胞培养工艺中，灌流生产工艺的占比仍不高，很大一部分原因是现有的生产设施多为针对补料分批操作而设计。
在最近的多项研究中，都提出了补料分批细胞培养工艺强化的概念。补料分批生产生物反应器中≥2x10^6 cells/mL的更高的起始接种细胞密度可通过N-1灌流种子培养来实现，相比传统批次式N-1种子培养，其可达到更高的终VCD。这基本上可将补料分批生产的早期细胞生长阶段转移到N-1种子培养步骤，降低了整体的补料分批生长持续时间，而可达到相似的最终滴度，同时获得更高的单位体积产量。与生产生物反应器灌流培养相比，结合N-1灌流的补料分批的主要优势是降低灌流培养基的用量以及其使用现有的补料分批生产，而只需要对N-1种子步骤进行简单的改动。
在原文中，研究人员介绍了一种使用CHO K1 GS细胞系进行多种mAb生产的强化补料分批平台。在其之前的研究中，已经证实在不使用灌流的强化补料分批工艺中，通过将接种密度从~0.5x10^6 cells/mL提高到3-6x10^6 cells/mL，可显著提高生产滴度。而在本研究中，研究人员使用N-1灌流，以10-20x10^6 cells/mL的接种密度接种生产生物反应器，实现强化的补料分批操作，在10-14天生物反应器运行后，将原使用3-6x10^6 cells/mL接种密度的无灌流补料分批的多种mAb的滴度提高了100%以上。且数据表明，强化的工艺可规模放大至500L，质量属性与此前1000L生物反应器相当。
细胞培养平台从传统补料分批生产（工艺A和工艺B）到强化补料分批（工艺C）的演变（J.Xu, et al., 2020）。
材料和方法
详细的细胞系、培养基、种子扩增、对照的补料分批工艺以及工艺内细胞培养和产物质量属性分析，请参考原文。
N-1 种子培养
对于批次和富集的批次N-1种子培养的细胞，根据补料分批生产生物反应器的规模，使用摇瓶、5L玻璃罐（Sartorius）、20L玻璃罐（Applikon）或200L一次性使用生物反应器（GE Healthcare）。用于工艺A和工艺B的N-1生物反应器以批次模式进行，用于工艺C的N-1生物反应器使用灌流模式运行。对于N-1灌流，生物反应器连接交替式切向流（ATF）设备，以灌注培养基。不锈钢XCell ATF 2设备用于在5L和20L生物反应器上进行的实验室规模N-1灌流，一次性使用XCell ATF 6设备用于在200L生物反应器上进行的大规模N-1灌流。新鲜的培养基连续补加，而耗竭的培养基以相同的速率连续去除。灌流速率根据在线电容探针检测的VCD进行控制，mAb1、2和4在第1天以0.04 nL/cell/day的速率开始灌流，mAb3以0.08 nL/cell/day的速率开始。温度和溶氧分别维持为36.5 ℃和40%，pH设定点为7.2。
批次N-1接种200L规模的工艺A、灌流N-1接种5L规模和灌流N-1接种200L规模的工艺C获得的a）活细胞密度（VCD）以及b）细胞活性趋势；使用工艺A接种1000L生物反应器和使用工艺C接种5L生物反应器和500L生物反应器进行随后的补料分批细胞培养时的c）VCD、d）细胞活性、e）标准化的滴度特性以及f）工艺内质量属性。mAb4使用工艺C进行500L规模操作时的第12天的最高滴度标准化为1（J.Xu, et al., 2020）。
工艺B和工艺C中，结合mAb1和mAb3数据的最终滴度和工艺内质量属性。为使统计分析更加高效，500L规模工艺C中mAb1和mAb3的平均最终滴度、主峰、G0F和单体标准化为1（J.Xu, et al., 2020）。
更多详细的结果和分析，请参考原文。
讨论
本研究中，强化补料分批平台开发的主要策略是使用N-1灌流、并重新设计用于高密度接种培养的基础和补液培养基，提高生产生物反应器接种密度至10-20x10^6 cells/mL。尽管本文只报导了4种mAb，但强化补料分批平台已经成功应用于我们生物制品管线中其它mAb的生产，并获得了相似的高滴度范围。
除了提高滴度和降低生产成本外，降低工艺开发时间线是生物制药行业的另一个目标。鉴于生物制药行业激烈的竞争状况，尽可能快地开发mAb工艺，并及时递交早期和晚期临床试验以及上市审批法规文件至关重要。一个强大的平台工艺可以显著地降低工艺开发时间，此外，对于工艺更多的了解以及工艺间的一致性也非常重要，这有利于工艺规模放大，使工艺在向生产转化时更加顺畅，也有益于下游工艺开发并实现一致的质量属性控制。在本研究中，用于mAb1和mAb3的强化工艺C策略的开发约耗时6-9个月，而用于mAb2和mAb4的工艺C达到相似的滴度仅用了3个月，证实了高滴度平台的优势。
在平台化强化工艺C策略的开发过程中，多个上游因素之间存在着相互作用，例如接种密度、基础和补液培养基的营养强度、补液策略、温度调整以及用于表达不同mAb的CHO细胞系的差异。研究中，工艺C提高滴度的机制对于不同mAb来说可能会有差异，如对于mAb2和mAb3，工艺C提高滴度主要是由于增加的VCD，而对于mAb1和mAb4，是由于增加的VCD以及更高的细胞特异性产率。所以，每种mAb都需要一些独特的调整，以达到更高的滴度，而不是一套平台参数适配所有产品运行。这些调整包括培养基富集和浓度、补液量和补液时间以及温度调控，这些可在小规模的高通量平台和实验室规模生物反应器中进行研究。
强化工艺已经成功应用于多个细胞系，与之前的工艺相比，可获得相当的产物质量属性。总体来说，由于物料成本和设备需求，在大规模条件下进行重复运行会有一定的挑战性。但不管怎样，工艺C的最终滴度比工艺B翻了一倍，且所有工艺内质量属性相当，例如电荷异构体、N链糖基化以及SEC杂质图谱。所以可认为，在本研究中，质量属性不受工艺的影响。
使用强化补料分批工艺进行大规模生产的一个主要潜在限制是N-1灌流种子培养步骤，据报导，使用倾斜式沉降器进行该步操作时，达到的最终VCD仅为15.8x10^6 cells/mL。但是，在我们的研究中，从使用1个XCell ATF 2的5L N-1灌流培养规模放大到使用1个XCell ATF 6设备的200L或500L N-1生物反应器均不存在太大的挑战。假设可以从500L N-1灌流工艺放大至含有1700 L培养体积的2000L N-1生物反应器，使用2个XCell ATF 10设备，2000L规模的N-1灌流培养量足以以12-17x10^6 cells/mL的接种密度、10,000– 14,000L的起始体积接种20,000L规模的大型生产生物反应器。所以，对于需求量较高的生物制品，强化工艺C可继续规模放大至20,000L生物反应器，而维持生产阶段的高滴度。
本研究开发的强化平台补料分批工艺C可高效用于mAb生产。由于细胞培养滴度和生产规模是决定生产成本的两个重要参数，具有更高滴度且可在大规模生产中进行成功规模放大的工艺C可使生产成本低于补料分批工艺A和工艺B。获得更高滴度和单位体积产量的高效mAb生产，加上更好的稳健性以及更低的成本是学术研究和生物制药行业共同的追求。为达到此目标，自90年代起，就已经对补料分批和灌流模式进行了广泛的研究。报导的补料分批培养可获得的滴度还在提升，说明其尚未完全成熟。而相比传统补料分批工艺，结合N-1灌流的强化补料分批工艺C可达到更高的单位体积产量，且工艺操作更加简单、稳健。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：J.Xu, M.S.Rehmann, M.Xu, et al., Development of an intensified fed‑batch production platform with doubled titers using N‑1perfusion seed for cell culture manufacturing. Bioresources and Bioprocessing, 2020, 1:17, https://doi.org/10.1186/s40643-020-00304-y.
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