用于灌流生物反应器操作设计的两步程序

来自瑞士苏黎世联邦理工大学和Merck Biopharm的科学家们在2019年7月的《Biochemical Engineering Journal》杂志上发表了题为“A two-step procedure for the design of perfusion bioreactors”的文章。

文中，研究人员开发了在给定表达系统条件下，用于治疗性蛋白质生产的哺乳动物细胞灌流培养设计和优化的两步程序。考查的操作变量包括细胞特异性灌流速率（CSPR）、灌流速率（P）以及活细胞密度（VCD）。

该程序可分为2个步骤，每一步都包括各自的反应器操作，以依序探索不同的稳态。在第1步中，找到合适的最低CSPR值。这可通过两种交替方法来完成，包括保持灌流速率或VCD恒定，而改变另一个，以降低CSPR，当CSPR最小化时，细胞生长和代谢产物的输入和输出速率降低，从而获得更低的废弃率和更高的工艺性能。在第2步中，通过适当地调节灌流速率，研究了在CSPR恒定而VCD增加条件下的稳态。在这种情况下，细胞活性保持恒定，而随着灌流速率的增加，收获产量和单位体积产率进一步提高。研究人员对程序2个步骤中的产物质量（电荷异构体、N-链糖基化）进行了研究，结果显示，在不同稳态下，仅有极小的变化。而如在程序中获得产物质量属性不能令人满意，则需以额外的步骤对其进行微调，如在补液培养基中加入添加物，可诱导显著的产物质量变化。本文为原文简介，详细内容，请参考原文。

简介

目前市场对单克隆抗体（mAb）产能的需求仍然很高，这使得连续灌流细胞培养作为一种生产系统受到了更多的关注。灌流生物反应器可实现更高的日产量、更小的设施占地、更均一的产物质量，且可进行稳态操作，其可实现所表达蛋白质的整合式、连续、端到端生产，这已得到了诸多研究的证实。在某些情况下，其被认为是最方便的生产策略。此外，灌流生物反应器已被视为当前批次或补料分批培养的有效强化工具。

灌流生物反应器工艺的开发由多个阶段组成，其从培养基设计和克隆筛选开始，当这些确定后，需要在实验室规模下设计一个工艺，之后进行规模放大，并在临床和商品化规模操作。为实现稳态灌流培养，并优化其性能，需确定灌流液的反应器体积特异性流速，P（VVD）以及活细胞密度（VCD），Xv（cells/mL）。这通常用产量最大化以及培养基消耗最小化来量化，前者定义为单位反应器体积和时间内所生产的蛋白质量，后者定义为单位产物产量所消耗的培养基量。生物反应器稳态的表征包括滴度和反应器体积特异性废弃流速（B），可通过以下质量平衡公式计算：

C_Titer = X_V * q_mAb/ P 

B = μ_specific

其中q_mAb（如pg_Protein/Cell/day）为细胞特异性产率，μ_specific（如l/day）为细胞特异性生产速率。

生物反应器操作条件的设计需满足已接受的设置和表达系统所导致的特定限制。通常，由于供养和搅拌（粘度）的局限，VCD不能超过最高值。灌流速率P的上限取决于细胞过滤单元的处理能力，而下限取决于蛋白质的平均滞留时间值，其对不稳定蛋白质来说至关重要。

灌流生物反应器中最常使用的重要参数是细胞特异性灌流速率（CSPR），（pL/cell/day），定义为向单个细胞每天补加的培养基的量：CSPR = P/X_v

为提高工艺性能，需降低CSPR，尽可能提高产率而降低培养基消耗。对于给定的培养基，会有一个CSPR的临界值，低于该值时，培养不能维持，所以，可以认为获得生物反应器的最佳性能时，应为CSPR的最低值，且灌流培养稳定，亦即CSPR_min。该参数与培养基“深度”高度相关，为给定培养基在给定灌流速率条件下可获得的VCD最大值。

原理上讲，可以设想两种方法来估算CSPR_min。“push-to-low”方法最初由Konstantinov提出，其在固定活细胞密度条件下，步进式降低灌流速率，以对递减的CSPR值进行研究。另一种“push-to-high”的方法则为在恒定灌流速率条件下，逐步提高活细胞密度。在两种情况中，CSPR在每一步都会降低，直到培养基限制或代谢物抑制导致工艺不稳定（如细胞死亡或细胞特异性产率降低），原理上应为相同的CSPR值，对应为CSPR_min。但是，需要注意的是，两种方法达到CSPR_min值的路径不一样。在第一种方法中，灌流速率降低，其可能导致不稳定产物过高的平均滞留时间，而在第二种方法中，VCD增加，其可能导致无法实现的极大值。

使用“push-to-low”和“push-to-high”方法确定CSPR_min的理论图示（M.K.F.Wolf，et al., 2019）。

确定CSPR_min后，可选择用于优化生物反应器性能的操作参数剩下P或VCD：它们的比例是固定的。第2个设计步骤包括步进式增加灌流速率和活细胞密度，以维持CSPR恒定。很明显，对于给定的设置，由于氧传质、二氧化碳去除、粘度或其它的限制，该操作会达到特定的程度。值得注意的是，对于不稳定蛋白质，第2步非常有益，因为提高流速降低了蛋白质在反应器内的滞留时间，从而防止了不必要的降解。

在本研究中，程序第一步通过使用push-to-low和push-to-high策略，评估了在三个连续稳态中合适的最低CSPR值，CSPR_min。在第二步中，通过研究多个P和VCD组合，且保持两者恒定的比例（即CSPR），以一个测试的CSPR，进一步提高反应器性能。总结来说，将两个步骤相结合，可确定从产率和培养基使用考虑，优化生物反应器性能的操作条件。

材料和方法

种子生物反应器

种子细胞复苏并在恒温摇床扩增后，接种至灌流生物反应器（Eppendorf，DASGIP，2.5L玻璃罐，工作体积2L）。系统配有外部回路，包括用于细胞截留的聚醚砜（PES）中空纤维（HF）组件（长度25cm、孔径0.5μm、过滤面积1570cm2，Spectrum Labs by Repligen）以及用作驱动的无轴承磁悬浮离心泵。泵组件操作并控制在1.6L/min。VCD在7天内从0.3增加至55x10^6cells/mL。反应器重量通过进样控制维持恒定。灌流速率在前四天控制为1VVD，然后增加至2VVD，以防止营养限制。

生产生物反应器

细胞转移至之前开发并良好定性的灌流生物反应器系统，以1.5L工作体积操作。反应器连接外置ATF2设备（Repligen），细胞截留使用相同的PES HF类型。ATF以恒定的1.2L/min的置换速率进行操作。总共进行3个实验运行，在每个中，连续研究2或3个不同稳态，主要研究的操作为P（VVD）、VCD（cells/mL）、CSPR（pL/cell/day）。

在第一个实验中（步骤1A），以不同的细胞特异性灌流速率作为目标。在恒定的1.0 VVD的恒定灌流速率条件下，VCD从30、10、20 x 10^6cells/mL连续变化。VCD设定点已在之前的摇管实验中进行预测试。下一个实验（步骤1B）在恒定的VCD 20x10^6cells/mL的条件下进行。灌流速率从1.0至0.66再至2.0 VVD进行更改，对应相应的CSPR的变化。第三个实验（步骤2）在恒定的50 pL/cell/day CSPR条件下进行。VCD从20至40再至30x10^6cells/mL进行连续变化，而灌流速率进行相应的调节。

在所有实验中，灌流速率通过反馈回路控制，以维持反应器重量恒定。废弃速率通过使用在线生物质传感器的自动控制器进行调节，以将VCD维持在所需的设定点。最后，收获流速维持在恒定的给定设定点。每日添加消泡剂，以防止泡沫积聚。

详细实验操作及结果，请参考原文

总结

灌流生物反应器操作的优化是一个复杂的过程，本文所描述的程序是一种可行的指南。在开始阶段，需建立一些性能标准和操作界限。对于给定的培养基，这些标准包括最低的细胞生长、可接受的副产物水平、所需的产物质量、最高可支持的VCD，VCD_max（取决于生物反应器设置、细胞截留设备以及包括氧气供养和CO2去除等的操作限制）以及最高可达到的灌流速率Pmax（从培养基体积和经济性考虑）。

基于这些标准，最方便的CSPR，即最低可持续的CSPR_min，可通过步骤1A或步骤2B找到，其包括连续的多个稳态运行，基于恒定灌流速率或VCD，而降低CSPR。一旦找到方便的CSPR，可通过实验步骤2获得最佳工艺参数，其使用CSPR_min，而提高VCD和P，直到达到VCD_max或P_max。在更高的VCD以及随后更高的灌流速率条件下操作，可降低产物的滞留时间（特别有益于较不稳定的蛋白质），而提高收率。

用于确定灌流生物反应器最佳操作条件的两步程序：步骤1包括通过在恒定灌流速率（步骤1A）或恒定VCD（步骤1B）条件下降低CSPR的实验，确定1个方便的CSPR（即CSPR_min）；在步骤2中，使用所选的CSPR，而增加VCD和P值，直到达到操作界限，确定最佳操作条件（M.K.F.Wolf，et al., 2019）。

在最佳操作条件下（CSPR_min、VCD_max和/或P_max），产物质量可在额外的步骤中进行进一步的微调，如在反应器补液中加入合适的添加物。本文方法具有相当的通用性，可用于其它的系统。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：M.K.F.Wolf, A.Pechlaner, V.Lorenz, et al., A two-step procedure for the design of perfusion bioreactors.  Biochemical Engineering Journal, 2019, https://doi.org/10.1016/j.bej.2019.107295.

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