用于疫苗和基因治疗的优化病毒纯化工艺

随着上游生产滴度的增加，用于疫苗和基因治疗的病毒颗粒的下游工艺已成为生产工艺的一个关键性瓶颈，而行业在开发效益、工艺效率等不断增加的压力下，新的下游技术也在不断出现。参考原文分析了病毒下游纯化工艺的现状，包括传统单元操作及其发展，并以工艺强化策略为重点，介绍了增加工艺效率的诸多途径，如基于多柱技术的连续或半连续系统等。本文为文章简介，同时补充了相关文章内容，详情请参考各原文。

在经历了较长时间的相对稳定期后，疫苗行业似乎开始进入了一个复兴期，其仍是极具吸引力的医疗工具，对制药公司来说，也是可持续的业务，原因包括：i）近年来，市场，特别是新兴市场，对疫苗需求的快速增长；ii）许多医疗需求仍未被满足，而疫苗在这其中可能可扮演决定性的角色；iii）随着免疫学和微生物学的发展，以及对传染病学更好的理解，以前较为棘手的靶标，现在可以通过疫苗接种预防了。而且，相比其它药品，疫苗受专利到期的影响相对较小，加上产品本身的复杂性，不太会出现收益急剧下降的情况，这也增加了商业模式的可持续性。

早期的疫苗主要由活性衰减病毒（如天花、狂犬）或灭活细菌（如百日咳）组成。现在，随着新技术的应用，开发有纯化的灭活病毒（如甲肝）、病毒样颗粒（如乙肝、HPV和流感）、共轭（如肺炎球菌疫苗）和多肽疫苗。此外，新的表达系统，如植物系统，正在优化疫苗的生产方式。

Protein Science的HA流感疫苗FluBlok® 的生产和纯化工艺流程图，使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）（J.O.Josefsberg, et al., 2012）。

Gardasil®病毒样颗粒疫苗的初始纯化工艺，使用酿酒酵母生产，需要破碎细胞，以释放病毒样颗粒（J.O.Josefsberg, et al., 2012）。

在这些新趋势中，病毒载体正变得越来越重要，其可同时表达多个抗原，同时避免使用感染性病毒可能出现的安全风险。病毒载体为重组病毒颗粒，可向患者递送基因材料或表达蛋白，治疗或预防疾病。一般认为该类疫苗比野生型或活性衰减病毒更安全，因其通常只含有传染性基因的一小部分。

已被使用的病毒载体包括痘病毒、疱疹病毒和腺病毒等。其中，腺病毒被认为是最适合疫苗开发的平台，因其可将DNA有效递送至靶细胞。不同的人腺病毒血清型正被评估用于开发更高效的疫苗，如用于HIV和疟疾的Ad26、Ad35和Ad5等。

腺病毒生产工艺，使用含HIV-1 p55 gag转基因的rAd5病毒载体感染PER.C6哺乳动物细胞（J.O.Josefsberg, et al., 2012）。

虽然非病毒递送方式也开始被用作基因治疗的工具，病毒载体仍是该领域最常用的工具，约占临床试验的2/3，其中，腺病毒是最常用的载体，此外，还包括逆转录病毒、痘病毒、腺相关病毒以及单纯性疱疹病毒等。

广阔的潜在应用范围，以及不断增长的医疗市场，正在推动病毒疫苗和基因治疗载体生产工艺的不断改进。发展中国家正成为主要的疫苗市场，所以开发“便宜”的疫苗非常关键，而通过优化生产工艺是达到此目的最可能、也最容易实现的途径。

近年来，上游工艺的发展极大地提升了生物反应器的产量，从而也将工艺瓶颈转移到了下游工艺（DSP），增加了下游的成本。有报道显示，DSP约占整体工艺成本的70%，所以，对其进行优化，将有利于建立更经济、高效的工艺流程。例如，使用灌流生物反应器，培养PER.C6，可获得10^8cells/mL的细胞密度，以此细胞密度，1000L的灌流生物反应器理论上可生产达10^19的腺病毒颗粒（10^5VP/cellx10^11 cells/L x 1000L），这就需要相应处理能力的下游技术，来实现上游工艺优化所带来的效益。

DSP的主要目标是去除杂质，包括工艺相关的（如牛血清白蛋白、核酸酶）或产品相关的（如宿主细胞蛋白、DNA、蛋白聚糖和糖胺聚糖）；其它产品相关杂质包括游离蛋白、聚集物以及空衣壳。DSP的最终目标是获得高纯度、效价和质量的产品，符合监管部门的要求。

监管部门对生物技术产品的大体规格要求（P.Nestola, er al, 2015）。

病毒和病毒载体是复杂的生物制药产品，其尺寸、形状以及表面结构千差万别，等电点、表面疏水性、有/无囊膜以及颗粒不稳定性等都在下游工艺设计中都扮演了重要的角色。病毒表面确定了其理化特性，包括电荷量级及分布、疏水残基以及表面蛋白的翻译后修饰（如聚糖）。与单克隆抗体相比，病毒生产中还需考虑其它因素：在整个生产流程中，生物反应器和纯化步骤需维持病毒或病毒载体的免疫源性和稳定性。此外，还需确保生产设备的安全评估，通常需要生物安全2级及以上。针对病毒的复杂性还要求有更优化的分析技术，如AF4-MAL、SEM、AFM，以评估最终产品的纯度和质量特性。

鉴于此，生物产品高效、可放大的纯化工艺必需通过结合数个单元操作来实现。传统的单元操作包括沉淀、离心、微滤和超滤、层析等，而现代化的工艺流程更需注意工艺定性及对制药质量源于设计（QbD）的理解。

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本文为下文简介，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。

原文：P.Nestola, C.Peixoto, R.R.J.S.Silva, et al., Improved Virus Purificaiton Processes for Vaccines and Gene Therapy. Biotechnology and Bioengineering, 2015, DOI 10.1002/bit.25545.

J.O.Josefsberg, B.Buckland, Vaccine Process Technolgy. Biotechnology and Bioengineering, 2012, DOI 10.1002/bit.24493.

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