病毒载体生产中的切向流过滤应用案例

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来自西班牙巴塞罗那临床医院等的科学家们在2018年11月的《Molecular Therapy : Methods & Clinical Development》杂志上发表了题为“Development of a novel anti CD19 chimeric antigen receptor for a Spanish approved clinical trial: a paradigm for an affordable CAR T cell production at academic institutions”的文章。

文中，为生产足够完成临床试验的慢病毒，对病毒生产方法进行了规模放大，且尽管从药物监管审批来看，慢病毒被认为是中间体试剂，但完整的生产工艺在符合GMP要求的洁净室内进行。每个批次由4L未浓缩的病毒组成，每批次的生产时间为12天。HEK293T细胞作为包装细胞系。开始生产前，准备HEK293T主细胞库和工作细胞库，以使所有批次使用来源相同传代的HEK293T生产。对于每次生产，先在摇瓶中两次传代，扩增HEK293T（从80x10^6cells至少扩增至2829x10^6cells）。然后，细胞转移至4个10层CellStack细胞培养舱以及1个单层CellStack，后者作为细胞增殖的对照。第2天进行质粒转染。之后2天后收集病毒上清液，并用0.45μm膜澄清。最终，使用配有500kD mPES中空纤维过滤器组件的KrosFlo Research IIi 切向流过滤系统对4L的病毒上清液进行浓缩和洗滤。每个批次最终浓缩至100mL，分配至10mL储袋，并于-80℃保存，以备使用。对制备的病毒进行滴度确定、无菌性及纯度分析。方法验证时，生产并分析了3个病毒批次。结果显示，冷冻浓缩的病毒滴度范围为1.1-2.2x10^8TU/ml。质控检测显示，所有三个批次无细菌-真菌生长、支原体或复制型慢病毒（RCL）。对主要病毒成分的PCR检测确认了病毒的一致性。

慢病毒生产工艺主要步骤概览（M.Castella, et al., 2018）。

摘要：表达抗CD19嵌合抗原受体（CAR）的基因修饰自体T细胞在CD9+ B细胞恶性肿瘤的临床试验（CT）中表现出了令人印象深刻的反应率。为将这种治疗方法用于我们的患者，我们开发了一种新型CART19，其基于我们自己的抗CD19抗体（A3B1），其含CD8铰链和跨膜区、4-1BB和CD3z信号域。我们的结果显示，A3B1 CART细胞在体外具有高细胞毒性和特异性抗CD19+细胞，诱导促炎细胞因子的分泌和CART细胞增殖。在体内，在NSG 移植瘤B-ALL小鼠模型中，A3B1 CART细胞可完全控制疾病发展。基于临床前数据，我们推论，我们的CART19具有针对CD19+细胞的明确功能，其水平与目前临床使用的其它CAR19相似。同时，我们描述了我们位于中等规模学术机构内的CAR T细胞生产系统的操作，其使用慢病毒载体和CliniMACS Prodigy系统。验证阶段的结果显示，我们的系统稳健且可重复，同时维持学术机构可负担的低成本优势。我们的模式可作为相似机构的范例，以帮助实现为所有患者提供CAR T细胞治疗的目标。

原文：M.Castella, A.Boronat, R.Martin-Ibanez, et al., Development of a novel anti-CD19 chimeric antigen receptor for a Spanish approved clinical trial: a paradigm for an affordable CAR T cell production at academic institutions. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development (2019), doi: https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.11.010.

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来自法国南特大学等的科学家们在2017年第28期的《Human Gene Therapy Methods》杂志上发表了题“Accurate Identification and Quantification of DNA Species by Next-Generation Sequencing in AdenoAssociated Viral Vectors Produced in Insect Cells”的文章。

文中，对于在昆虫细胞sf9中进行的重组腺相关病毒（rAAV）生产，细胞以摇瓶或2L生物反应器培养，密度达到10^6cells/mL时，以0.05MOI感染，感染后四天，加入Triton X-100，裂解细胞，并加入Benzonase降解核酸。培养液离心或深层过滤收获。收获的载体以CsCl梯度超速离心或亲和层析纯化。纯化的病毒载体使用100kD mPES MicroKros中空纤维过滤器组件进行浓缩，并以含/不含0.001% PF-68的DPBS制剂，以备后续分析。

摘要：重组腺相关病毒（rAAV）载体已被证实是治疗多种遗传性疾病和其它复杂疾病的出色工具。但是，病毒颗粒中不合理衣壳化的DNA污染物是基于rAAV的治疗方式的一个主要安全问题。而且，用于早期临床试验的rAAV载体的开发过程已经显示，可用于这些新型复杂药物鉴定的分析工具准确性有限。尽管大多数已发表的关于rAAV制品中残留DNA的数据都使用定量PCR获得，但是我们之前已开发了一种新型的单链病毒测序（SSV-Seq）方法，使用下一代测序（NGS）技术，对以哺乳动物细胞生产的AAV载体中的DNA污染物进行定量。这里，我们介绍使用SSV-Seq，对以昆虫细胞生产的rAAV储液中的DNA物质进行准确鉴定和定量的方法。我们发现，杆状病毒DNA是丰度最高的污染物，无论哪种血清型（2、8或rh10），占NGS读数低于2.1%。Sf9生产细胞DNA在rAAV批次中检测到的频率较低（≤0.03%）。高级计算机分析显示（1）靠近反向末端重复序列的杆状病毒序列会优先发生不合理的衣壳化，（2）rAAV基因组中没有单核苷酸变异体。本文所述的高通量测序方法可实现对以昆虫细胞生产的rAAV载体进行有效的DNA质量控制，并适应监管机构的安全要求。

原文：M.PenaudBudloo, E.Lecomte, A.GuyDuche, et al., Accurate Identification and Quantification of DNA Species by Next Generation Sequencing in Adeno Associated Viral Vectors Produced in Insect Cells. Human Gene Therapy Methods, 2017, 28:148-162.

3

来自日本医科大学等的科学家们在2016年第3期的《Molecular Therapy — Methods & Clinical Development》杂志上发表了题为“Ultracentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1 (rAAV1)”的文章。文中使用配有中空纤维过滤组件的KrosFlo Research IIi 系统对HEK293细胞培养的上清液进行过滤和浓缩，以进行后续硫酸铵沉淀、离子交换及凝胶过滤层析等处理步骤。

摘要：重组腺相关病毒（rAAV）是一种非常有吸引力的基因递送工具，具有用于人体基因治疗的潜力。目前从转染的细胞裂解液中生产和纯化rAAV的方法主要基于氯化铯和碘克沙醇密度超速离心，但这种方法不能规模放大。而基于层析的系统更具可放大性。所以，在本研究中，我们开发了一种从无血清的培养上清液中生产和纯化rAAV血清1型（rAAV1）的新方法，其基于离子交换和凝胶过滤层析，是一种无需超速离心的技术，可获得高度纯化的产物，适用于GMP生产。纯化的rAAV1在SDS-PAGE分析中显示出3条清楚且锐利的条带（VP1、VP2和VP3），且据负染电镜分析显示，90%以上收获的rAAV1颗粒含有完整包装的病毒基因组。从4x10^9 HEK293细胞纯化的rAAV1的基因组滴度为3.63 x 10^13 v.g./ml（总滴度为4.17 x 10^13 v.g.）。这种基于层析的新方法可促进基因治疗中临床应用生产的规模放大。

原文：T.Tomono, Y.Hirai, H.Okada, et al., Ultracentrifugation free chromatography mediated large scale purification of recombinant adeno assocated virus serotype 1 (rAAV1). Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2016, 3: 15058.

文章摘要为编者翻译，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

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