从1mL到57L规模预装柱的装填质量、蛋白质结合载量及分离效率
可抛弃型技术正越来越受到生物药生产的欢迎。商品化的制备型预装层析柱已可提供从50μL至85L规模柱体积，以批量或整合式连续工艺模式，用于纯化工艺开发、临床前、临床和商品化生产。预装柱在生产过程已通过质量检测确认，证实在独立单元操作中具有所需的功能性。在生物工艺行业中，已有较多理论和实际的方法被引入用于确保层析柱的放大性能。对于装填柱床从小规模到大规模的可放大性来说，最重要的参数是所有规模条件下相同的装填质量。此外，还需要考虑柱外效应对可靠预测柱效规模放大的影响。通过对缓冲液过渡曲线变化的评估可确定校正因子，以更有效地预测在更大规模下的洗脱行为。当传质是控制谱带展宽的机制时，通过维持保留时间恒定，可对层析柱操作进行规模放大，在保守的方法中，这可通过维持所有规模层析柱的柱床高度恒定、增加柱直径、维持线速度以及样品上样体积和柱体积比例来实现。
此前已有研究表明，小规模预装柱可在10年的生产期内维持一致的填料床质量。最近亦有研究对小规模预装柱的柱间装填差异进行了定量，其值非常低，即其具有充分的质量，可用于工艺开发和规模缩小研究。此外，使用非保留丙酮脉冲获得的质量结果显示，装填不同介质的0.2-20mL柱体积的预装柱具有良好的可放大性。根据层析柱质量检测的结果，可推测用于蛋白质分离时的柱效也可规模放大，因为对于保留的蛋白质来说，柱外体积和装柱质量的影响较前者而言相对弱化。已有研究证实，大规模预装柱的性能与自装柱相当。
设计使用自动工作站操作的预装柱可用于1ml实验室规模预装柱的模型分离研究，但用于蛋白质分离的预装柱从实验室到生产规模的可放大性的研究相对较少。研究不同体积规模预装柱的可放大性时，还需考虑系统的影响，特别是需要混合器形成不连续梯度时。而在小规模层析中，系统配置是造成总体谱带展宽的重要影响因素。
原文中，研究人员研究了是否可使用1mL至57L的预装层析柱对蛋白质分离工艺进行规模放大。通过比较流穿曲线和获得的结合载量，证实了预装柱在整个规模范围内的适用性。此外，使用不连续梯度洗脱，在所有预装柱规模下，对由溶菌酶、细胞色素C以及核糖核酸酶A三种蛋白质组成的混合液进行了分离，通过RP-HPLC对各个蛋白质馏分纯度的分析确定蛋白质分离效率。
实验使用OPUS MiniChrom、OPUS ValiChrome和OPUS 10-60 cm ID预装柱。所有预装柱装填65μm 阳离子交换介质 Toyopearl SP-650M。下表为预装柱的高度、直径和体积信息。MiniChrom和ValiChrom预装柱使用ÄKTA pure 25M2层析系统操作。OPUS 10cm预装柱使用ÄKTA Pilot层析系统操作。所有其它OPUS预装柱使用QuattroFlow 1200S泵提供运行缓冲液和上样材料，使用蠕动泵注入脉冲。
实验检测预装柱的内径、柱床高度和柱体积信息(S.Schweiger, et al., 2019)。
丙酮脉冲实验、流穿实验、不连续梯度实验、反相HPLC分析等实验操作及相关计算理论请参见原文。
所有测试的1mL至57L体积的预装柱的装柱质量和一致性使用不同流速条件的丙酮脉冲实验进行确认。
在4种线性流速下分析了多根预装柱丙酮峰的峰距。（A）针对柱外体积校正的第一峰距，第一峰距随柱体积线性增加，说明所有规模预装柱具有相似的装填质量和总体孔隙度；（B）柱外体积与柱体积的比；除1mL柱比例较高外，所有预装柱的柱外体积比低于CV的5%，前者受柱外体积效应影响较大；（C）第二峰距，其与柱体积相关，这在大规模预装柱中得到证实。
在150cm/h线性流速下丙酮脉冲实验测得的HETP和对称性。计算的所有规模的预装柱的HETP值范围为0.027-0.098cm之间，颗粒外孔隙度范围为0.36-0.49。
在溶菌酶结合载量测试中，获得了除60cm ID预装柱外所有预装柱上的溶菌酶流穿曲线。
上图为在8min保留时间下的溶菌酶流穿和计算的结合载量。（A）所有预装柱上标准化后的流穿曲线的叠加，可见线型非常相似，50%流穿时的斜率为1.08±0.13CV-1。（B）溶菌酶的平衡结合载量（EBC）和动态结合载量（DBC）。所有预装柱的溶菌酶EBC相同，平均EBC为26.6±0.9mg/mL，10%流穿时的DBC为21.3±0.9mg/mL，说明所有规模预装柱具有相似的柱效。EBC和DBC的轻微差异可能是由于上样过程中缓冲液的盐浓度差异所致。
随后，实验在所有预装柱上使用步进式梯度分离了溶菌酶、细胞色素C和核糖核酸酶A三种蛋白质的混合液。蛋白质混合液上样后，用上样缓冲液漂洗，然后三步洗脱蛋白质，每步使用不同的盐浓度，并高盐再生。
溶菌酶、细胞色素C和核糖核酸酶A混合液的不连续梯度洗脱，保留时间8min。（A）所有预装柱获得的色谱图的重叠，实线为UV，虚线为电导。核糖核酸酶A第一个洗脱，细胞色素C其次，溶菌酶在梯度的第三步洗脱。可见开发的梯度可分离三种蛋白质。（B-D）不同规模预装柱三步独立洗脱步骤的峰宽、峰面积及保留时间等参数。
使用RP-HPLC对所有评估的所有规模预装柱的上样样品及三步梯度洗脱池中的溶菌酶、细胞色素C和核糖核酸酶A的纯度进行定量。结果证实所有规模预装柱的层析性能相当，即装填Toyopearl SP-650M的1mL （0.5 x 5cm）到至少75L（60 x 20cm）的预装柱对于该蛋白质混合液的分离性能相似，亦即证实了所有规模预装柱的填料床一致性和装柱质量。
本文证实了使用从用于工艺开发的实验室规模预装层析柱到用于cGMP生产的大规模预装柱进行工业化蛋白质层析的成功规模放大。使用易受装填结构变化影响的丙酮脉冲实验确认了不同尺寸预装柱装填的一致性，丙酮脉冲注射实验确认用于每种规模阶段的所有预装柱，根据HETP和对称性检测数据，装填至相同的质量属性。为证明预装柱可被接受用于实际蛋白质分离工艺，我们进行了流穿曲线实验，并使用步进式梯度方法进行了蛋白质分离实验。模式蛋白质的平衡结合载量和动态结合载量结果显示，不同规模预装柱只有轻微的差别，其可能原因是上样缓冲液盐浓度较小的变化所致。使用相同的条件，在每个规模的预装柱上，对由三种蛋白质组成的混合液以不连续梯度方法进行了分离。尽管保留时间和峰宽度略有差别，但所有规模预装柱的每个梯度步骤所获得的洗脱池的纯度相当，前述的差别是由于混合导致的电导变化的锐度差异以及小规模层析柱更加显著的柱外效应所致。
总结来说，评估的所有规模预装层析柱，从0.5cm x5cm（1ml）至60 cmx20 cm（57L）填料床体积，装填一致且具有良好重复性，可用于从实验室到生产规模的蛋白质分离工艺的开发和规模放大。
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参考原文：S.Schweiger, E.Berger, A.Chan, et al., Packing quality, protein binding capacity and separation efficiency of pre-packed columns ranging from 1 mL laboratory to 57 L industrial scale. Journal of Chromatography A, 2019, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.01.014.
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