BHK-21细胞ATF灌流培养，生产寨卡病毒

Repligen瑞普利金 2022-12-21

寨卡病毒（ZIKV）是一种由节肢动物传播的囊膜病毒，属于黄病毒科黄病毒属，病毒颗粒粒径为~50nm。最近，寨卡病毒在美洲和太平洋地区的传播已经在60多个国家达到了令人担忧的水平，而关于该病在病毒学、流行病学以及对人类影响的了解又相对较少。因此，需要大量体外培养巴西寨卡病毒物料，以建立定量分析方法，支持体外、体内更加完整的病毒学和免疫学等研究。

寨卡病毒通常使用Vero或蚊C6/36（Ae. albopictus larvae）细胞系生产，Vero细胞已被证实具有良好的安全特性，经批准用于多种人病毒性疫苗的商品化规模生产，而蚊C6/36细胞仅用于虫媒病毒的基础研究。但这两种贴壁依赖型细胞都存在一定规模化生产限制，难以保证寨卡病毒和寨卡病毒抗原的大量、及时供应。故而，可生产足量病毒滴度的悬浮细胞系的鉴定将显著有助于寨卡病毒疫苗生产平台的建立。基于此，原文报导了一个基于BHK-21悬浮细胞（BHK-21SUS）在灌流生物反应器中大量增殖巴西寨卡病毒的生产平台。

实验先在组织培养瓶中使用贴壁BHK-21和Vero细胞进行了先导实验，显示其对四种不同巴西寨卡病毒株具有相似的容忍度和病毒产量。但各个病毒之间感染性病毒颗粒的细胞特异性产量各不相同（1-48 PFU/cell），且实验显示，分离自巴西州Pernambuco的寨卡病毒分离株（ZIKVPE）在两种细胞系中均为最佳分离株。此外，在摇瓶中进行的ZIKVPE的BHK-21SUS细胞感染性研究显示病毒复制能力较差，最高滴度为8.9x 10^3 PFU/mL，对细胞内和细胞外病毒RNA水平的进一步RT-qPCR检测显示，在细胞内有高病毒拷贝数，但病毒释放较差。详细细胞系和培养条件、寨卡病毒增殖、定量等内容，请参考原文。

克服以上工艺局限的一种策略是通过提高细胞浓度以实现工艺强化。所以，随后使用交替式切向流过滤系统（ATF）在灌流生物反应器内，以受控的工艺条件进行了培养。实验使用Merck Millipore Mobius 3L可抛弃型搅拌罐反应器、Applikon 控制单元及Repligen XCell ATF 2系统。pH和溶氧探针及灌流导管与泵外壳和PES中空纤维过滤器（0.2μm孔径、1mm ID、0.13m2表面积，产品编号F2：RF02PES）高压灭菌并在无菌条件下连接至生物反应器罐。

培养工作体积1.2L，BHK-21SUS起始接种浓度7x10^5cells/mL，在第5天，以基础生长培养基置换0.7个反应器体积（RV），以避免培养基成分剥夺。之后，使用补充灌流培养基开始连续培养基灌流，灌流速率从开始的0.15 RVD逐步增加至0.42 RVD，以将葡萄糖浓度维持在5 mM以上。当细胞浓度达到约1.2x10^7 cells/mL时，停止灌流，通过中空纤维过滤器去除30%的无细胞培养基。随后，浓缩的细胞病毒感染，MOI为0.001，并周期性搅拌（开3min，关15min），以促进细胞的病毒感染。病毒吸附后1h，搅拌重新设置为120rpm，生物反应器补充新鲜基础生长培养基至起始工作体积。3h后重新开始灌流，灌流速率0.15 RVD，以维持葡萄糖浓度高于5mM，通过补加0.5M NaOH，维持pH为7.1，直到工艺结束，以保证最佳细胞生长条件，降低pH诱导的病毒失活。

BHK-21SUS灌流生物反应器培养，以在更高细胞密度条件下生产寨卡病毒。■为BHK-21SUS细胞浓度时间线，感染后浓度下降是由于病毒感染导致的细胞裂解所致。Δ为寨卡病毒滴度变化时间线。实线为灌流消耗的培养基体积 (A.Nikolay, et al., 2018)。

细胞浓度可达到1.2x10^7cells/mL，病毒滴度3.9x10^7 PFU/mL。尽管细胞特异性产量相比贴壁细胞低，为3.3 PFU/cell，但感染性病毒颗粒的总数量显著增加。从总体病毒生产优化来看，使用ATF2系统进行一次培养，可替换90多个175cm2、40mL 组织培养瓶。

实验建立的灌流工艺为研究提供了大量的寨卡病毒材料，这也是开发灭活或减毒寨卡病毒疫苗生产工艺的第一步。

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参考原文：A.Nikolay, L.R.Castilho, U.Reichl, et al., Propagation of Brazilian Zika virus strains in static and suspension cultures using Vero and BHK cells. Vaccine, 2018, 36:3140-3145.