在GMP环境下进行临床I/II期慢病毒载体生产
在2020年出版的《Chimeric Antigen Receptor T Cells: Development and Production》一书中，包括了题为《Phase I/II Manufacture of Lentiviral Vectors Under GMP in an Academic Setting》的章节。文中，作者指出，在临床转基因应用中，慢病毒载体（LV）已经迅速成为在靶细胞中永久且稳定表达目的基因或改变基因表达的主要方法，主要原因在于LV有能力可以（1）转导分裂和静止的细胞、（2）通过囊膜假型包装限制或扩大向性以及（3）通过内部启动子选择，调节不同细胞系中的基因表达。最近在病毒载体设计方面的进展，如消除不必要的病毒元件以及自灭活载体，已经为这些载体建立了一个重要的安全档案。
LV生产要求的GMP合规水平取决于其目的用途、药物产品开发所处的阶段以及载体将在哪个国家使用，因为审查此类产品临床使用的不同监管机构可能会有不同的要求。因此，成功的LV GMP生产需要综合考虑不同的因素，包括法规专家、合规的工厂设施、经验证并校准的设备、高质量的起始材料、训练有素的生产人员、科学且稳健生产工艺以及QbD（质量源于设计）方法，此外，还需要有权驳回或批准物料的独立质量保证部门对整个生产过程进行监督。
作者介绍了他们工厂进行的LV GMP生产流程，其使用4质粒系统，来自经批准的主细胞库（MCB）的293T细胞使用PEI瞬时转染。转染后，置换培养基，加入Benzonase消解残留的质粒DNA，收集粗上清液，过滤澄清，澄清的上清液以阴离子交换层析和切向流过滤纯化并浓缩，然后，终产物直接洗滤换液至预先确定的制剂缓冲液并无菌灌装。
本文将主要介绍使用切向流过滤进行LV浓缩的操作方法，因每家公司的目的要求、生产环境以及已有物料条件的不同，实际的操作细节可能会有所差别，具体需求可以联系我们的技术专家。但原文操作可作为参考，工艺流程中其它步骤的操作介绍，请参考原文。
切向流过滤
按下图所示，使用TFF管路套件1B、2A、2B和3B，在生物安全柜内无菌组装TFF中空纤维柱流路。（中空纤维过滤器供应商亦提供包括过滤器、管路、压力传感器等部件的完整预组装、预灭菌的封闭式流路，直接安装至系统后即可使用，从而节省流路搭建时间，并确保工艺过程的无菌性。）
切向流过滤（TFF）系统流路组装及洁净室操作。a）TFF系统、泵、配件和相关管路的示意图：TFF系统泵、支架、工艺袋、辅助蠕动泵等在生物安全柜内搭建，天平和计算机等可置于生物安全柜外。所有连接在生物安全柜内进行。图中“P”和“X”所示位置为压力传感器和止血钳（管夹）。b）在GMP车间内进行的TFF操作：LV生产过程中的TFF系统操作在洁净室内的生物安全柜中进行。计算机安装KF Comm软件，其从KrosFlo泵和天平采集数值，计算剪切等工艺参数。
使用无菌镊子将硅胶垫圈置于法兰和TFF组件之间，用卡箍紧固3/4”接头。
在底部滤液端口的鲁尔接头上连接一个60mL注射器，并用止血钳夹闭管路。
用堵头封住所有开放的管路，如上图所示。
将止血钳置于管路套件2A上，如上图所示。
连接3个压力传感器，如上图中“P”所示，用鲁尔帽密封。
将TFF管路套件3A连接至2B，如上图所示，管路通过蠕动泵泵头。
将1个20L生物工艺袋连接至滤液管路，标记为废液，放在天平上。天平去皮。
将压力传感器和天平数据线连接至KrosFlo泵(参见备注1）。
将KrosFlo泵连接至运行KF Comm数据采集软件的计算机。
将含有20%乙醇的4L袋连接至TFF管路套件3A，如上图中指示的“Supply Bag”（补液袋）位置。（不同材质的中空纤维膜可能需要使用不同性质的溶液，20%乙醇一般建议用于聚砜PS材质的中空纤维膜）
使用蠕动泵，将全部体积转移至“Processsing Bag”（工艺袋）。
使用KrosFlo泵，将20%乙醇泵过中空纤维柱，泵速设置为1,070mL/min。
当乙醇流动通过中空纤维柱，并部分从滤液端口流出，部分回流通过回流管路，调节回流管路上的背压阀，以达到5psi的跨膜压（TMP）（参见备注2）。
运行系统，直到大部分乙醇通过管路进入废液袋。注意，中空纤维柱内不要流干。反转泵，将剩余的20%乙醇返回至补液袋。
将20%乙醇袋切换为5L的无菌水袋，使用蠕动泵将其转入工艺袋。
使用KrosFlo泵，以1,070mL/min的流速，将水泵动通过中空纤维柱，使用回流管路上的背压阀，将TMP控制为2-6psi。
在工艺袋泵空前，将泵速降低至540mL/min，打开回流管路上的背压阀。
继续运行泵，直到所有水从工艺袋抽出进入中空纤维柱，空气开始进入管路，停止泵运行。
夹闭回流管路，将泵速设置为0.1L/min。
启动泵，使进样压力达到5-7psi。停止泵，夹闭进样管路。
进样压力平衡后，按以下步骤，对中空纤维柱进行完整性测试，1）记录起始进样压力，2）计时1min，观察进样压力，3）1min后，记录最终进样压力。如果起始和最终压力变化低于0.5psi，继续进行后续操作。如果高于该值，重新准备一根TFF中空纤维柱（参见备注3）。
反转蠕动泵，去除工艺袋内剩余的水。
将无菌水袋切换为TFF平衡缓冲液袋（1L），使用泵，将缓冲液转入工艺袋。
打开进样和回流管路。
将KrosFlo泵的泵速设为1,075mL/min，使用回流管路上的背压阀，将TMP调节为5psi。运行泵，直到大部分的缓冲液流出，但不要使中空纤维柱内完全流干。
反转蠕动泵，去除工艺袋内剩余的TFF平衡缓冲液。
将TFF平衡缓冲液袋切换为含有稀释的层析洗脱液的料液袋，将其泵入工艺袋。
将滤液袋切换为一个新的20L滤液袋，天平去皮。
以约1,075mL/min的泵速运行KrosFlo泵，启动KF Comm软件，记录压力、重量、泵速以及计算的TFF剪切力。剪切保持在3,700-4,000S-1范围内，维持TMP为5psi。
尽可能浓缩体积，但注意，不要将空气引入系统。
工艺袋抽干前，将层析洗脱液袋切换为2L洗滤缓冲液袋，将其泵入工艺袋。
运行KrosFlo泵，使用KF Comm软件，监测TFF条件，如步骤29所述。保持剪切为3,700-4,000S-1，TMP为5psi。
尽可能地浓缩体积，但注意，不要引入空气。如观察到过多的泡沫，停止泵运行。最终体积约为150-300mL。
停止泵运行，结束数据采集。
用止血钳夹闭滤液管路，打开背压阀，使用连接的60mL注射器，向TFF组件内推入60mL空气。重新夹闭注射器管路。
降低KrosFlo泵一半泵速，至约538mL/min，使系统循环产物约3min。
3min循环后，降低工艺袋位置，使其低于泵，保持泵运行，直到所有产物进入工艺袋。不要让产物重新进入系统。如有必要，反转泵，使残留的产物流出柱子。
在工艺袋的鲁尔管路上连接一个Baxa #21泵，将产物转入预先称重的无菌250mL储存瓶中。
将终产物灌装进指定的终产物容器内。大多数情况下，选择每个1.8mL冻存管灌装500μL。
取样进行产物安全性检测。
产物于＜-70℃储存。所有样品提交进行批次出厂检测（参见备注4）。
备注：
使用KF Comm软件时，操作人员可实时监测TFF中的压力和流速，并对每个TFF系统部件做出调节，以降低生产批次间的差异，特别是维持工艺开发中建立的参数。TFF工艺完成过程中，应尽量减少停顿。
乙醇的背压可能不足以自然形成较高的TMP，但应尽量使其接近5psi。这可通过调节回流管路上的背压阀来实现。
TFF柱出厂前已由厂商进行了完整性检测；但是为确保柱子在润湿和冲洗之后仍保持完整性，建议重新检测。
产物出厂前需进行的特定批次出厂检测的内容应在病毒生产前根据监管部门或特定客户需求确定。通常需进行的检测内容包括：无菌性、内毒素、复制完整慢病毒（RCL）、支原体、体外外源性病毒分析、载体滴度（效价）、物理滴度、残留核酸酶、载体插入序列、残留细胞DNA、残留质粒DNA、残留牛血清白蛋白（BSA）、表观、pH、残留宿主细胞蛋白以及渗透压等。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：A. Dasgupta, S. Tinch, K. Szczur., et al., Phase I/II Manufacture of Lentiviral Vectors Under GMP in an Academic Setting. Chimeric Antigen Receptor T Cells: Development and Production, Methods in Molecular Biology, 2020, vol. 2086, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0146-4_3.
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