用于T细胞治疗的逆转录病毒的连续生产工艺

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

来自美国国家卫生研究所和约翰霍普金斯大学等的科学家们在2018年第132期的《Biochemical Engineering Journal》上发表了题为“Continuous production process of retroviral vector for adoptive T- cell therapy”的文章。文中，为对逆转录病毒载体生产进行规模放大，使生产细胞PG13在配有交替式切向流（ATF）灌流装置的搅拌罐生物反应器内的微载体上生长。微载体是10μm-0.5mm的微球，可用于支持细胞的贴附，并悬浮于生物反应器内，以提供受控的生长条件。这样，即可对生长参数进行监测和连续的控制，如溶氧浓度、pH以及营养物质。该工艺对特异性病毒载体滴度或其在患者T细胞转导中的载体效率无不利影响。在11天的灌流周期中，病毒载体滴度增加，获得4.8x10^11转导单位（TU），平均滴度4.4x10^7 TU/mL，平均特异性产率10.3（TU）/cell，说明这种方法是大量生产用于临床使用的活性病毒载体的有效途径。本文为原文简介，详细内容，请参考原文。

简介

过继性T细胞治疗是一个快速成长的领域，其使用患者的免疫系统来对抗肿瘤细胞。患者自身的T细胞经基因工程修饰，增强其与肿瘤细胞的相互作用，提高其对抗肿瘤细胞的能力。一种T细胞修饰的途径是使用逆转录病毒载体对收集的患者细胞进行转导，从而向患者T细胞增加肿瘤特异性T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CAR）。转导之后，修饰的细胞回输至患者。

逆转录病毒可使用源于稳定表达Meloney 小鼠白血病病毒gag-gol蛋白和Gibbon ape白血病病毒囊膜蛋白质的NIH3T3小鼠细胞的PG13包装细胞系进行生产。此类细胞可被编码TCR或CAR的γ-逆转录病毒转染，以生产分泌型逆转录病毒。自2006年以来，很多研究小组报道了使用PG13源性病毒载体进行T细胞受体和嵌合抗原受体的制备。PG-13细胞一般为贴壁细胞，使用培养板、滚甁或细胞工厂生产，在以批次模式进行病毒载体生产过程中，培养基可收获多次。最近，有报道使用固定床生物反应器进行了此类细胞的增殖，其可实现连续的培养基置换和载体收获，提高生产效率。

另一种可行的方法是使用微载体，以支持贴壁性PG13细胞的生长。微载体是一种粒径约10μm-0.5mm、带电荷的多孔性微球，其可在培养基中悬浮，为贴壁细胞提供生长表面。微载体已被有效用于贴壁细胞的生物反应器培养，用于生产不同的生物产物。微载体已被用于疫苗类的细胞和病毒生产（如脊髓灰质炎病毒）以及抗体和重组蛋白。最近也有报导使用微载体进行间充质和多能干细胞的生长和扩增。

微载体可为在生物反应器中生长的贴壁细胞提供支持，所以，与其它贴壁细胞培养方法一样，其表面积是有限的，如3g/L Cytodex 1可提供的表面积是13.2cm2/mL。由于微载体处于悬浮状态，所以可置换培养基，并将细胞保留在生物反应器内，而不干扰其生长，这种模式可模拟悬浮培养条件，进而延长生产周期。

原文实验提出了一种在配有交替式切向流（ATF）灌流装置的生物反应器内，使用微载体，连续、大规模生产逆转录病毒载体的方法。

实验

详细的实验设置、操作说明及分析方法请参考原文。

实验使用Sartorius工作体积1L的通用型生物反应器及GEHC的Cytodex 1微载体（浓度3g/L），并如下图所示，搭建了用于微载体培养（ATF2 MC）的交替式切向流（ATF）单元，其使用微载体筛网过滤器组件（孔径73μm，162cm2），使用C24控制器操作。在第二天，打开ATF，压力设置为0.9，排气设定为0.3，系统润湿，以用于灌流。生物反应器以批次培养模式运行，直至第四天，启动补液和收获泵，补液和收获流速设置为0.69mL/min，以在24小时内完整置换一反应器体积。每24小时采集收获液以进行检测，样品保存在-80℃冰箱内，以备进一步使用。

生物反应器设置。图中显示带ATF截留装置的灌流生物反应器的布局。泵流速分别控制，ATF带有独立的控制单元，细胞培养参数通过生物反应器控制单元进行调整（S.Inwood, et al., 2018）。

讨论

病毒介导的基因递送是对人淋巴细胞和其它细胞进行基因修饰的有效方法。所以，在单个载体产品可对用于多个患者的细胞进行工程改造的情况中，使用PG13细胞生产足够量的逆转录病毒载体是进行成功的细胞治疗研究的基本前提。PG13是贴壁细胞，所以传统上用于悬浮哺乳动物细胞大规模生产的搅拌罐式生物反应器不是一种可行的方法。所以，现有的源于PG13细胞的病毒载体的生产方法是使用细胞工厂、滚甁以及固定床生物反应器。本文报导使用搅拌罐生物反应器，通过灌流方式连续置换培养基，在微载体上增殖PG13细胞，以进行逆转录病毒生产的工艺。在此工艺中，细胞被截留在生物反应器中15天，其理化状态保持稳定，包括代谢物和营养物浓度以及病毒载体生产滴度特性。在灌流过程中，从1L生物反应器连续收集了11L体积，收集转导单元为4.8E11，说明平均特异性产率为10.3TU/cell。

过滤装置的保留体积约为350mL，置换体积约为100mL；当系统操作时，1L生物反应器约有一半的量保留在过滤单元内，该状态实际上适合维持生长以及载体的生产。基于测试的过滤装置的性能，作者预计，相同尺寸的过滤单元可能适合灌流更大的体积，预计可达5L，且可提供更均质的培养。使用截留装置的一个未预期的优势是提高了PG13细胞微载体培养的溶氧供应，主要是截留装置的抽吸和排放过程所形成的。直接将空气和氧气鼓入微载体培养体系会导致PG13细胞围绕气泡形成聚集，但是表面通气，结合截留设备的切向混合以及生物反应器的垂直混合，可以很容易地在整个工艺过程中维持设定的溶氧条件。实验中工艺维持了15天，但显然可维持更长的时间，以连续生产更多的病毒载体。

现有的生产策略，如使用滚甁进行的静态工艺，虽然稳定，但非常耗时耗力，且需要较大的占地，固定床生物反应器是另一种可能的生产方式，其可消除静态培养的一些限制，可降低对表面积的要求，且可维持pH和DO等生长参数，但其混合能力较差，所以限制了营养物质的分布，细胞可能不能同等地获得所需的基本生长因子。文章使用的连续工艺，利用ATF设备，可使用微载体获得悬浮样灌流培养，是生产大量临床使用所需活性病毒载体的有效途径。

原文：S.Inwood, H.Xu, M.A.Black, et al., Continuous production process of retroviral vector for adoptive T-cell therapy. Biochemical Engineering Journal, 2018, 132: 45-151,

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