与补料分批“头对头”比较显示，灌流细胞培养可降低工艺和产物异质性
来自美国Sanofi的研究人员在2019年第14期的《Botechnology Journal》杂志上发表了题为“Perfusion cell culture decreases process and product heterogeneity in a head-to-head comparison with fed-batch”的文章。文中，研究人员使用产IgG1和IgG4细胞系，比较了补料分批和灌流平台对工艺和产品属性的影响。在实验规模条件下，两种平台均使用“即插即用”方法，使用商业化的基础和补液培养基，补料分批使用标准补液策略，灌流使用ATF过滤系统。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
商品化生物生产工艺的细胞培养操作有两个主要目的，首先，操作必须生产具有一致、可控质量属性的生物制品，以保证安全性和效力。其次，产品的生产效率必须足够高，以使整体工艺经济可行。产物质量和产率一直以来都是细胞培养工艺开发的主要驱动力。
补料分批生物反应器在目前的生物蛋白生产中较常使用，经过过去几十年来的发展，该平台已可稳定提高产率。而近来，灌流细胞培养系统由于更高的细胞密度和更长的运行时间，已被证实可实现显著的产率提升。许多理论性或实验性的分析已经比较了两种平台的产率，证明对于稳定蛋白质（如单克隆抗体）的生产，灌流可获得与补料分批相当甚至更好的结果。
但另一方面，关于补料分批和灌流系统中产物质量的直接比较报道较少。已经达成的共识是，灌流生物反应器是不稳定蛋白质的标准解决方案，因这类产物在补料分批环境中不能保持其质量。但是，两个不同平台对于稳定产物质量的影响并不多见。一些研究证实两种培养模式均可始终一致地维持产物质量，而另一些研究报导则称灌流培养可获得更复杂糖基化的物质、降低被裁剪物质的形成、提高特异性活性，并降低聚集体和酸性成分。
为了更完整地了解这种影响，以及更好地开发用于比较和控制不同模式中产物质量的方法，更好的了解培养模式对产物质量的影响有利于根据项目目标，在药物开发或生命周期管理中选择特定的生产模式。这种深入理解也有利于在开发或生产一个特定产物的过程中，实现培养模式之间的无缝转换，而不显著影响产物的质量。
理论上讲，在一致的细胞密度和恒定的灌流速率下进行灌流操作可以更好地控制产物质量。尽管在典型的补料分批生物反应器中，大部分关键参数也会受到控制，如溶氧、pH和温度，但是另有一些因素，如营养物和废物浓度以及渗透压，不能精确控制，需要大量的工艺开发工作，以确定操作空间。将恒定灌流速率与细胞密度控制回路相结合可以更严格的调节这些因素，进而形成一致的代谢和产率。灌流也可提供具有更窄滞留时间分布的产物分子，降低产物在细胞外酶（如蛋白酶、糖苷酶、唾液酶）以及细胞外环境（pH、温度）中的暴露。细胞环境、细胞代谢和产物环境控制的提高可相应地提高产物质量属性的控制，包括聚集、片段化、电荷异构体、糖基化和杂质。
生产培养
生产生物反应器未针对任意培养模式和细胞系的组合进行优化，而使用简单的“即插即用”方法。15L生产生物反应器起始接种密度0.5x10^6 cells/mL。补料分批生物反应器使用Thermo Fisher的CH CHO培养基和Efficient Feed B作为基础和补液培养基。起始工作体积8L，在第3、6、9和12天，补液960mL。补料分批pH维持为6.95。灌流生物反应器使用CD CHO培养基，工作体积为10L，反应器配置使用0.2μm聚醚砜（PES）中空纤维组件的交替式切向流（ATF）过滤设备。灌流在接种后一天以1VVD的速度开始，然后在第5天增加至2VVD。培养基补液泵与培养基补液天平偶联，生物反应器收获泵与生物反应器天平偶联，以分别自动化控制灌流速率和生物反应器工作体积。生长期后，生物反应器废弃泵与Aber Instruments的在线Futura电容探针偶联，以通过连续的细胞废弃，将活细胞密度控制为30 x10^6cells/mL。电容读数通过离线细胞计数定期确认。生物反应器pH开始控制为7.1，收获阶段控制为6.9。从第5天开始，向反应器半连续性添加FoamAway消泡剂，以控制泡沫。
详细的实验操作及结果分析，包括种子细胞扩增、产物质量分析、代谢和产率计算以及统计分析，请参考原文。
结论
补料分批中的产物浓度比灌流高2.5倍，但灌流的平均产率比补料分批高7.5倍。PCA分析显示，在补料分批过程中，细胞环境和代谢的变异性更高。LDH检测显示，在补料分批中，产物在细胞裂解物中的暴露高7-10倍。产物分析显示，在灌流中，天然种类物质的丰度更高，可能是由于生物反应器内滞留时间和细胞外暴露的降低。IgG1灌流产物还具有更高的纯度和更低的半抗体。所有培养模式的糖基化相似。详细实验和分析结果，请参考原文。
IgG1和IgG4细胞系补料分批（红色）和灌流（蓝色）系统中的活性（A）、活细胞密度（B）、产物浓度（C）和产率（D）(J.Walther, et al., 2019)。
IgG1和IgG4 细胞系补料分批（红色）和灌流（蓝色）相关运行内变量主成分分析可视化图：A）细胞环境，B）细胞代谢，C）产物环境。
总结来说，通过本研究，研究人员开发和应用了一种直接的实验方案来比较细胞培养的补料分批和灌流模式，包括用于数据分析的新的数学公式。这些研究显示灌流生物反应器内具有均一的环境和代谢条件，相应的，灌流模式生产的产品质量相对更均一，特别是从电荷异构体和纯度考虑。
原文：J.Walther, J.Lu, M.Hollenbach, et al., Perfusion cell culture decreases process and product heterogeneity in a head-to-head comparison with fed-batch. Biotechnology Journal, 2019, 14（2）：1700733.
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