病毒样颗粒（VLP）洗滤重组装及工艺监测

来自德国卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）的科学家们在2019年1月的《Biotechnology and Bioengineering》杂志上发表了题为“Process monitoring of virus‐like particle reassembly by diafiltration with UV/Vis spectroscopy and light scattering”的文章。文中，实验人员成功将在线检测回路与KR2i 切向流过滤系统相整合，以在以洗滤模式进行病毒样颗粒（VLP）重组装的过程中，执行工艺分析技术（PAT），实现实时的工艺监测。下文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

背景

病毒样颗粒（VLP）是一类非常有潜力的生物药，可用于对抗多种疾病，包括病毒和细菌感染、肿瘤、阿尔兹海默氏症以及自体免疫失调。VLP通常设计通过其表面递呈抗原而触发免疫反应，这些抗原可以是天然病毒衣壳的一部分或人工引入，例如，基于乙肝核抗原（HBcAg）、乙肝表面抗原（HBsAg）、GH1-Qβ以及小鼠多瘤病毒VP1（MuPyVP1）构建的嵌合VLP。VLP可耐受大多数环境应激，所以多数情况下，可“相对便宜”地进行生产，且由于其重复的、颗粒状结构，可有效地诱导高效的免疫反应。

与病毒相似，VLP由一种或多种类型的衣壳蛋白组装形成更高级的结构。VLP在基因修饰的宿主内表达，之后以沉淀、层析以及超滤/洗滤等技术进行纯化。体内自组装、无囊膜的VLP通常需体外解聚并重组装，以去除衣壳内的杂质。解聚和重组装也有助于提高结构均质性，优化整体稳定性，并增强免疫源性。

典型的VLP生产工艺流程（M.Rudt,et al.，2019）。

通过改变理化环境，如改变蛋白溶液的离子强度、pH或还原剂的浓度，可诱导VLP四级结构的变化。在实验室规模下，透析是最常用的缓冲液置换方法，而在制备型的下游工艺中，切向流过滤（TFF）更受欢迎，因其可简单规模放大，减少缓冲液消耗，且可缩短处理时间。TFF已成功用于VLP的捕获、缓冲液置换以及浓缩。但在TFF操作，如缺乏为工艺参数、进程的监测和调控，可能无法获得最优化的目标结果，影响产物质量和收率。使用工艺分析技术（PAT）可监测以切向流过滤进行的VLP组装工艺的进程，包括蛋白质浓度、颗粒粒径以及蛋白质三级结构等信息的检测。

实验

原文实验在商品化KR2i 切向流过滤系统基础上进行了定制化的设置，原系统配置改性聚醚砜（mPES）中空纤维组件（MWCO 10kD、膜表面积 13cm2）以及1个50ml 锥底样品容器，同时，检测回路包括了UV/Vis光度计以及散射光度计。这些传感器可用于检测蛋白质浓度、蛋白质三级结构以及蛋白质四级结构。散射可提供组装过程的信息，而UV/Vis可检测蛋白质浓度和VLP组装速率。同时，使用离线动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）确认VLP形成。最后，偏最小二乘法（PLS）模型被用于预测工艺溶液中的VLP浓度。

实验设置中的管路和仪器布局。右下方为在线检测回路，其余部分是TFF管路。所有传感器连接至计算机，以采集数据。电子通讯线路以虚线表示。I-5是由封闭回路控制的夹管阀，用于控制TMP（M.Rudt,et al.，2019）。

实验使用三种乙肝核抗原（HBcAg）异构体对设置进行了测试，每种异构体在不同的跨膜压（TMP）条件下进行三次重组装工艺。实验前，TFF单元和检测回路用超纯水充满。检测器调零。之后，TFF单元和检测回路先用解聚缓冲液冲洗，之后更换至25ml的蛋白质溶液。TFF泵设置为70ml/min，中空纤维内相应的剪切率约为6000S-1，检测回路泵设为1ml/min，并开始获取数据。5min后，在0.25、0.5或1bar的TMP条件下，开始以重组装缓冲液作为稀释液，进行恒TMP洗滤。每0.5个洗滤体积（DV）时，从取样端口取0.4ml样品。实验在3DV时结束。每次实验后，TFF膜用超纯水及0.1M NaOH溶液清洗。

详细试验操作及结果，请参考原文。

以洗滤进行的VLP组装的过程

HBcAg二聚体在洗滤过程中颗粒的形成以及预期的传感器响应。洗滤过程根据在每个阶段不同的反应分为I – III期（M.Rudt,et al.，2019）。

在以洗滤进行的VLP组装的过程中，根据组装的进程以及传感器的响应，可将整个过程分为3期。在第I期，开始缓冲液置换，但没有发生组装，即VLP浓度为0。但是可能会形成聚体，导致散射光强度和z-平均粒径上升。

在第II期，同源二聚体组装形成VLP。天然HBcAg VLP直径为30nm-34nm。VLP浓度增加至其最大值。散射光密度和z-平均粒径继续提高。为了更准确地解释传感器的响应情况，第II期分为两个亚期 – IIa和IIb。在IIa期，z-平均粒径和散射光均提高，而在IIb，散射光强度进一步提高，但是z-平均粒径保持恒定。散射光强度的提高是由于VLP和聚体的不断形成而导致的。相反，z-平均值保持不变是因为它是一个强度-加权谐波平均值。当z-平均值接近VLP粒径时，进一步组装对z-平均值的影响很小，而散射光强度会随颗粒的形成继续增加。

在第III期，VLP浓度不再增加，组装过程结束。从z-平均值和散射光强度降低可说明聚体减少。散射光强度和UV吸光度的降低以及z-平均值恒定说明总蛋白质浓度降低，而粒径分布恒定。

结论和展望

VLP是一类在临床效果和市场方面都有较大潜力的生物药产品。无囊膜、体内组装的VLP通常需要体外解聚并重组装，以提高颗粒的稳定性、均质性以及免疫源性。在工艺规模条件下，切向流过滤是最常用的以洗滤模式进行重组装的方法。原文成功发了一种实验规模的TFF装置，其整合了在线检测回路，以执行工艺分析技术（PAT），为使用切向流过滤进行VLP重组装的开发和监测提供了一个有力的平台，可在VLP组装过程控制中，通过PAT决策技术，提高产物质量并强化工艺。

原文：M.Rudt, P. Vormittag, N.Hillebrandt, et al., Process monitoring of virus‐like particle reassembly by diafiltration with UV/Vis spectroscopy and light scattering. Biotechnology and Bioengineering, 2019, DOI: 10.1002/bit.26935.

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

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