ATF灌流技术：提高补料分批产能，减少种子扩增步骤

用于生物药生产的传统补料分批工艺在从冻存管冻融到大规模补料分批生产生物反应器接种之间需要进行多个阶段的种子扩增步骤。而ATF灌流系统可显著减少种子扩增步骤数，缩短补料分批生产的操作时间，从而获得显著的产能提升和成本节约。

如下图所示，相比传统细胞培养工艺中低密度的冻存管，使用ATF系统可制备保存于100mL和1L冻存袋的高密度冻存-种子-中间体（HDCSI）CHO细胞。而在种子扩增过程中，使用中试规模ATF-6灌流生物反应器（200L）作为n-1操作，可以10E6 cells/mL的密度接种2,000L生产生物反应器，比一般接种密度高30倍。整个工艺可使种子扩增的时间以及生产生物反应器的培养时间降低14天。下图为使用ATF的优化工艺与传统工艺的比较：

材料和方法：

• 选择行业相关的哺乳动物CHO DP12细胞系（ATCC# CRL-12445），用于评估使用ATF-2灌流系统的种子扩增工艺。CHO DP12细胞经驯化，可使用添加100ng/mL LONG R3 IGF-1和4mM 谷氨酰胺的CD OptiCHO培养基悬浮培养。该细胞系报导可表达重组人抗IL-8。

• 准备高密度冻存袋（Charter Medical）用于灌装所需体积的条件培养基，细胞密度100E6 cells/mL。条件培养基含5%（v/v）DMSO和0.11%（w/v） 羧甲基纤维素（CMC）（Sigma # C4888），作为冻存保护剂。灌装后的冻存袋置于冻存盒（Custom Biogenics Systems）内，冻存盒置于架子上排列存放，放入液氮前，这些架子在-80℃冰箱内保存24小时。

• ATF-2系统（Repligen）包括一台C24控制器（2.5版）、连接至隔膜泵的0.2μm中空纤维过滤器以及一台真空泵系统。所有的灌流运行以1LPM的ATF速率操作。

• 1.5L玻璃生物反应器（Applikon）连接至ATF-2灌流系统，用于获得100E6 cells/mL VCD，并用于模拟n-1种子扩增步骤（200L 生物反应器），使用1,5L玻璃生物反应器（无灌流）模拟2,000L生产补料分批生物反应器。

结果

1）用于冻存种子中间体的灌流

进行ATF灌流研究，获得100E6 cells/mL VCD，以制备HDCSI 冻存袋（条件培养基使用5% DMSO和0.11% CMC作为冻存保护剂）

2）使用冻存袋（100mL）的n-1灌流

这是n-1灌流生物反应器，反应器接种细胞来自高密度（100E6 cells/mL VCD）冻存袋。

3a）生产补料分批（VCD和活性）

生产补料分批：细胞从上述n-1灌流生物反应器直接接种，接种密度0.5E6和10E6 cells/mL。

3d）生产补料分批（mAb滴度）

在高接种密度补料分批生物反应器中，可在更短的时间内，观察到相当的滴度。

3c）生产补料分批（特异性产率）

在补料分批生产中，使用0.5E6和10E6 cells/mL接种密度的培养获得的细胞特异性产率非常相似（~6.3 pg/cell/day）。

4）n-1灌流，大规模冻存袋（100mL & 1L）

从100mL冻存袋和1L冻存袋冻融复苏的细胞回收率和生长曲线相似。

总结

• 使用ATF灌流技术成功进行了高效的补料分批工艺，种子扩增和生产时间显著降低。优化的工艺包括使用ATF制备高密度冻存-种子-中间体（HDCSI）和n-1种子扩增，以及高接种密度补料分批生产生物反应器。该方法不仅可使工艺总体时间降低14天（包括生产阶段减少7天），还可减少种子扩增步骤数，从而根本性地提高产能，节省操作/设备成本。

• 相比常规/低接种密度工艺，高接种密度补料分批生物反应器，在时间缩短50%（7天 vs. 14天）的情况下，可获得相当的蛋白质滴度和细胞特异性产率。

• 冻存条件经筛选确定：选择5%（v/v）DMSO + 0.11%（w/v）CMC是基于冻融后收率及生产特性（数据未显示）。100mL和1L冻存袋获得的冻融后回收率和生产特性相似。
  

缩写注释：ATF（交替式切向流）、BR（生物反应器）、CD（化学限定）、CMC（羧甲基纤维素）、HDCSI（高密度冻存种子中间体）、IVCC（完整活细胞计数）、LPM（升每分钟）、n-1（生产生物反应器之前的最后一个种子扩增阶段）、SD（接种密度）、VCD（活细胞密度）

原文：M.Sinani, T.Erlandson,S.Kudugunti, et al., ATF Perfusion Technology: Improved Fed-Batch Throughput and Reduced Seed Train Expansion. Poster @ BPI 2015.

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