一次性使用TFF策略：现代化生物药生产的最佳适配技术！

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

很多年来，生物药生产商都在努力提高生产能力、解决上游生产问题以及提高产量。上游技术近来来的发展已可显著提高表达量，从而提高上游生产能力。更高滴度的成功获得以及更严格的质量和法规要求已将诸多挑战转移至下游，而首要目标是使下游的技术有能力处理上游所能获得的更高的滴度。一般认为，下游工艺成本约会占到总生物药生产成本的70%，所以，迫切地需要可优化产物收获和纯化的技术。为克服这些挑战，最可行的解决方案是：流线化操作、开发新兴技术和/或使用可抛弃型产品。

生物药生产商对一次性使用技术的兴趣在不断增加，也进行了较多的开发工作，包括上游的一次性使用生物反应器和下游的储液袋、快接头以及囊式过滤器等。一次性使用系统基本上可在生物药生产的所有方面使用，包括药物的生产、储存、转移、过滤、纯化以及分离。生物技术行业已经完全认识到了一次性使用产品在节省时间、劳动力以及成本方面的显著优势。可抛弃型设备提供的灵活性可提高生产，消除对在线蒸汽灭菌（SIP）或在线清洗（CIP）以及相关产品验证的需求，苛性化学品和纯化水的用量可最小化，甚至消除，交叉污染的风险也可显著降低。

但是，很长一段时间来，“可抛弃”的概念仅限于直流过滤步骤（如除病毒过滤和除菌过滤），可抛弃型设备在这些步骤中已经证明了其效率。但是，一个典型的下游纯化工艺通常包括多个切向流过滤（TFF）单元操作，而直到最近，很多TFF还仅以重复使用形式进行操作。一般情况下，采用一次性使用TFF工艺策略可显著节省时间和资源。原文应用新近开发的经济模型，比较了用于TFF工艺的重复使用和一次性使用膜包，特别是在预浓缩TFF步骤中性能。

典型下游工艺

关于TFF的简单介绍

在下游工艺中，基于膜的TFF单元操作通常用于蛋白质的澄清、浓缩和纯化。在TFF中，溶液沿过滤器膜表面“切向”泵过。当施加压力后，液体中的一部分穿过膜进入滤液一侧。颗粒和大分子因为粒径较大而被截留，随料液流动而在膜表面形成“冲扫”作用。这使得TFF成为了基于粒径的精细分离的理想选择。

单克隆抗体（mAb）的下游工艺通常包括一个或多个超滤/洗滤（UF/DF）步骤，这也是TFF被最多使用的应用。这对于从缓冲液成分中分离蛋白质、以在终产品灌装前进行换液、浓缩或制剂特别有用。UF/DF步骤的目的主要是最终制剂前，降低批次体积，并置换缓冲液。

TFF系统具有高度可预测的性能特性、可放大性、简单易用、快速以及可靠性 – 所有这些都是该方法成为大多数生物药应用首选分离方案的原因。TFF系统通常用于需对溶液中不同分子量的蛋白质进行分馏的应用。工艺除需可靠、可放大且稳健外，还需可确保高产品质量、活性和回收率以及可控的内毒素水平。

经济模型

生物药的下游纯化工艺通常包括多个TFF步骤。一般情况下，使用一次性使用TFF工艺可显著节省时间和资源。为突显这些优势，进行了经济性研究。

典型TFF工艺的多个部分会使用传统的可重复使用设备，包括工艺前准备、样品处理以及工艺后处理。下图所示为工艺的组成部分，并按进行每个部分的时间进行了百分比划分。可见，一般情况下，在总操作时间中，仅50%被用于产品料液的处理。剩下的一半被花费在TFF系统的准备和清洗上。

典型TFF工艺的组成

一次性使用TFF工艺也可以进行相似的拆分。下图所示为按每个操作所占的时间百分比进行拆分后的工艺组成。在这里，总时间的80%被用于产品料液的处理，从而提高工艺效率，并显著节省总的工艺时间。

一次性使用TFF工艺的组成

当然，一次性使用TFF有特定的经济性限制，多个关键因素会影响其经济性，其中两个是膜面积和每年运行的工艺循环数。下图所示为在不同工艺规模条件下，要求的工艺循环数和与一次性使用TFF相关的节省百分比。很明显，一次性使用TFF技术在工艺开发和中试规模（＜5m2）条件下最具优势。在大规模条件下，当工艺循环数＜20时，也具一定优势。

不同规模条件下，不同循环次数的节省百分比，模型考虑了系统设计、在线清洗（CIP）、劳动力以及耗材。

比较可重复使用和可抛弃型TFF膜包

文章案例研究比较了用于mAb平台工艺中预浓缩步骤的标准可重复使用再生纤维素膜包和预消毒的一次性使用TFF膜包。该预浓缩步骤开发用于临床II期生产运行中mAb的纯化。客户需要约1kg的mAb用于临床研究。

整体工艺描述：使用CHO细胞在1,000L生物反应器中生产一定量的mAb。mAb表达为胞外产物，分泌至细胞培养基中。使用0.2μm孔径的深层滤器去除细胞质并滤液收集mAb。浓缩和换液之后，料液上样至捕获层析柱。

捕获层析为亲和protein A步骤。其它下游纯化步骤包括离子交换和疏水作用层析以及除病毒步骤（过滤和溶剂/去垢剂灭活）。为减少捕获层析上样时间，使用超滤降低样品体积，并提高蛋白质浓度。5倍浓缩后，样品体积降低至200L，蛋白质浓度增加至1.0mg/mL，浓缩完成后，进行4体积换液，以去除部分小分子量污染物。

TFF步骤要求：澄清后，滤液中的mAb浓度为~0.2mg/mL（200g/运行）。需要运行10次，以获得足够用于临床检测的mAb量。与我们的经济性比较结论一致的，客户决定使用可抛弃型工艺，以降低获得临床所需物料的设备要求。而通过减少清洁验证，该公司还可以节省金钱、时间和资源。

采用一次性使用策略，我们比较了两种用于在捕获层析前进行初步mAb浓缩和洗滤的商品化方案：使用HyStream 30kD 高亲水性聚醚砜（PES）膜的Repligen预消毒可抛弃型SIUS膜包以及传统的30kD再生纤维素超滤膜包。两者均在单次运行中以可抛弃型膜包形式使用。用于初步浓缩和洗滤的UF系统含有可抛弃型流路，包括硅胶管、料液袋以及可抛弃型监测仪表。所以，系统或UF膜不需要进行清洗。

实验和结果

理论上，获得临床所需物料需使用1,000L生物反应器。使用膜表面积0.02m2的实验室规模SIUS-LS HyStream 30K膜包进行了规模缩小试验。实验的起始进样体积为2L，起始进样物料体积和膜表面积之比为100L/m2。规模放大至1000L批次时所需的膜表面积为10m2。缓冲液消耗为1,200mL（60L/m2），仅用于平衡步骤（无需CIP、冲洗和平衡，因为可抛弃型SIUS膜包已预消毒，使用前可直接平衡）。

5倍浓缩后，样品体积从2,000mL（起始体积）降低至400mL（浓缩后终体积）。收集的洗滤滤液体积为1,600mL（4DV）。总工艺时间为3.25小时，包括1.62小时的洗滤时间和1.63小时的浓缩时间。浓缩时的滤液通量为49.1LMH，洗滤时的滤液通量为49.5LMH。

使用膜表面积0.0088m2的传统30kD再生纤维素UF膜包进行了相似的实验。但是，起始进样体积为1.46L，所以起始进样物料和膜表面积之比为166L/m2。规模放大至1,000L批次所需的膜表面积为6.0m2，缓冲液消耗为1,232mL（140L/m2）。在此案例中，需增加80L/m2的起始CIP和冲洗（除60L/m2的平衡步骤缓冲液消耗之外），得出总消耗量为140L/m2。5倍浓缩后，样品体积从1,460mL（起始体积）降低至292mL（浓缩后终体积）。洗滤体积为1,168mL，对应4DV。总工艺时间为8小时，平均通量为~44LMH。

每个实验重复两次，下表为结果总结。明显，使用一次性使用系统可显著降低时间和缓冲液消耗，因为大部分的时间被用于实际的样品处理。

实验结果

成本比较

进行了上述实验室规模研究后，对工艺进行了放大。考虑每个工艺的规模放大要求，可形成相同的比较和结果。使用相当的膜表面积（10m2）和相对等同的工艺时间（3.5小时），对相同的工艺进行了比较。SiuS HyStream 30kD膜包成本为$400/0.5m2，而传统再生纤维膜包成本为$1,850/m2。所以一次运行使用可重复使用膜包的成本估计为$37,000（20x0.5x$1,850）事实上，由于传统膜包的单位面积工艺成本更高，出于成本原因，比较使用10m2 SIUS膜表面积和6m2传统膜表面积。

针对10次运行的总工艺要求，使用一次性使用膜包的工艺的成本节省。

工艺进行10次，以生产所需的mAb量。上表比较并总结了结果和成本节省情况。

对于TFF步骤，经济性模型比较了使用可重复使用和可抛弃型膜包的工艺成本。可抛弃型TFF可在大多数背景下具有实际的优势，特别是R&D和临床试验中的生物药生产。多个因素会影响一次性使用TFF的经济性，其中两个是工艺要求的膜表面积和循环数。此外，一次性使用系统可显著降低交叉污染风险。也可以达到更高的生产灵活性。

案例研究考虑使用1,000L的CHO细胞培养生产一定量的mAb，比较了传统可重复使用TFF膜包和可抛弃型预消毒TFF膜包。结果证实，一次性使用SIUS膜包相比传统TFF工艺，具有更优化的成本效益，以及使抛弃型TFF的优势最大化的能力。

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本文为下文简介，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。

原文：H.Chochois, J.Blehaut, M.Labreck，A Presanitized, Purpose-Designed, Single-Use TFF Strategy: A Cost-Effective Process for TFF Steps in Biopharmaceutical Purification. BioProcess International, 2009.