工艺开发预装层析柱的应用

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

层析在早期工艺开发活动中的应用可根据所使用的层析柱的尺寸、数量和质量分为两个基本领域：筛选和工艺开发。

填料和条件筛选

筛选的目的是针对每一个工艺步骤，评估尽可能多地可行层析填料，包括捕获、精制I和精制II。此外，评估待优化的可能条件也非常重要，包括保留时间、pH和摩尔浓度。针对每一个步骤都需要进行一系列的因子试验。

用于高通量筛选的Repligen RoboColumn® 预装层析柱。

以往，开发团队需要在试验开始前，花费数周来装填这些层析柱，而手动装填的层析柱往往较大，也就意味着需要更多的试验蛋白。显然，这些局限性会限制试验性工艺评估的空间，从而影响构建“真正”优化的纯化工艺。而现在，早期工艺筛选可使用商品化小规模层析柱平台进行，即使用多根预装特定测试填料的小规模预装层析柱。预装柱通常可使用来自大部分供应商提供的填料，体积范围1-2mL。而最近的筛选用预装柱技术可将柱体积降低至50-600μL，该产品使用含有不同填料类型的平行排列阵列板，且几乎可装填所有类型的商品化填料。研究人员可将其筛选矩阵扩大至覆盖所有类型的填料和条件，而不需要使用大量的蛋白质。这些微型预装柱设计可允许手动操作或使用自动化液体工作站实现完全自动化的功能操作。此类现代化的预装柱可使研究人员将时间集中于开发工艺数据，而不是装柱操作。研究人员可更快、更省力地测试多种不同层析柱/条件组合，以进行更高效、全面的mAb工艺开发。

工艺开发

“最佳可行填料”的初步筛选完成后，即可进行工艺开发和细化。针对每个工艺步骤，工艺开发的细化一般聚焦于1-3种候选填料。这些填料在动态流速条件下进行测试，使用基本的保留时间、流速、pH和离子强度工艺条件。工艺开发层析柱需装填相同的填料至相同的柱床高度，并在柱效（塔板数）和不对称性等检测指标方面，保证装填柱床具有相同的质量。为达到此目的，装柱必须小心，并关注其后将用于规模放大层析柱的参数细节。所以，在筛选过程中使用的微型或小型层析柱不太适合更为细节化的层析评估，因其要求对动态液流条件的精确模拟。同样，工艺开发团队的挑战是装填用于工艺的多根层析柱：根据待评估的填料和条件数量，在此阶段，可能需要30根甚至更多的层析柱。这些层析柱装填需具可重复性，并可代表最终生产规模。装填这些层析柱将对工艺开发团队造成额外的时间和资源压力。

用于工艺开发的Repligen MiniChrom 预装层析柱

预装柱可用于此应用，但对其质量和一致性需小心选择。为模拟更大规模工艺层析柱的性能，预装柱直径需至少为0.5-1.2cm，且柱床高度应可尽最大可能地模拟工艺规模层析柱的所需保留时间。虽然如预装柱装填良好，不对称性可模拟工艺规模参数，但装填这些小规模层析柱时，柱壁效应会造成不小的挑战，这也意味着，对于任意给定填料，其功能塔板数会低于大规模层析柱。使用相同的填料，以相同的方式，良好装填的工艺开发层析柱，应具有与工艺规模层析柱预期的水平下限接近的一致塔板数。此类层析柱的体积一般为3-10mL，所有需要更多的测试蛋白质，也就是说需尽可能减少试验条件的数量。

最近，多家供应商推出了适用于该规模的预装柱，以替代自装层析柱。预装柱的潜在优势是优化工艺开发团队的资源利用、覆盖不同填料和条件的装柱一致性，以及，如工艺规模预装柱亦由同一家供应商装填，可确保不同规模的性能可比性。从经济角度看，虽然自装柱和预装柱技术的相对成本需根据每一种情况进行考量，但过往的经验显示，预装柱的成本并没有过高。而且机会成本、资源评估成本、以及对自装柱质量和重新装填的现实评估，往往会得出预装柱成本效益更好的结论。

工艺优化和故障排除

工艺优化和故障排除涉及与工艺优化相似的讨论，也使用相似尺寸的层析柱（一般为1-2.5cm，其与更大的工艺规模层析柱更具可比性）。工艺优化的目的是用从筛网过程中所选择的最终填料和条件，在规模缩小的动态流速条件下，优化工艺。为确定最佳的物理、化学、流速和体积参数，这些规模缩小的层析柱需尽可能地模拟将在最终工艺中使用的层析柱装柱规格。

相似的，在工艺故障排除中，层析柱需能尽可能地反映其所模拟的工艺规模层析柱。当cGMP规模放大工艺步骤发生变化或需要进一步优化时，往往需进行故障排除。在更大规模的层析柱上进行故障排除并非不常见，因为此时有更多的蛋白质产品可用于试验，且更大规模的层析柱可更好地预测工艺性能，因为可消除柱壁效应对层析柱装填质量的影响。所有，在这种情况下，使用有“中间性”直径规格层析柱选择的预装层析柱平台就变得特别有用，如2.5、5、8和10cm直径规格，其可获得规模放大工艺数据。

用于工艺验证，包括除病毒验证，的Repligen ValiChrom预装层析柱

除病毒验证

除病毒验证要求使用与工艺开发和优化相似的层析柱尺寸（一般为1-1.2cm）。此类层析柱应足够大，以支持与更大的工艺规模层析柱的性能比较，而不需要消耗过多的测试蛋白质。当可用的测试蛋白量有限时，也可使用直径0.5cm的层析柱替代。

预装柱技术的优势与前文应用相同，即一致性与优化的资源利用。但是，随着所需层析柱数量的增加，这些优势也将相应地倍增。除病毒验证是化学、生产和控制（CMC）递交的关键部分，通常需要5个或更多的重复数据。对于一个使用三步层析进行纯化的mAb产品来说，即意味着需要装填至少15根相似的层析柱（三种填料，5个重复）。在某些情况下，重复的研究可将层析柱数量增加至30-40。

由于涉及到质量控制（QC）、质量保证（QA）和法规方面的事务，且可能需要进行特定的供应商质量确认、验证信息以及审计，提前计划并小心选择层析柱将变得更加重要。此外，这些验证研究通常会由合同研究组织（CRO）进行，其一般具有较强的病毒操作、管理和测试专业性，但不一定具备出色的层析或装柱能力。而如果项目发起方的工艺开发团队自己装填玻璃柱，就对其增加了装柱以及将大量的测试层析柱运输到CRO（希望运输过程不会改变测试层析柱的柱效）的问题。在此类应用中，预装层析柱的优势还可在前文所述优势上进一步扩展，因为预装柱供应商会有经确认的运输程序，且可能有超千根预装柱的运输经验，并文件记录运输后的性能，包括对运输前层析柱测试参数的维持。

在后续文章中，我们将介绍中试及生产规模层析柱的形式、适用、功能及行业案例，尽情关注。

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原文：S.K.Tingley, DISPOSABLE PREPACKED‐BED CHROMATOGRAPHY FOR DOWNSTREAM PURIFICATION: FORM, FIT, FUNCTION, AND INDUSTRY ADOPTION. Process Scale Purification of Antibodies, 2017.