批次和连续生物药抗体生产的经济性分析

来自美国新泽西州立大学等的科学家们在2019年1月的《Journal of Pharmaceutical Innovation》杂志上发表了题为“Econmic Analysis of Batch and Continuous Biopharmaceutical Antibody Production: a review”的文章。文章聚焦于mAb生物药生产的经济性分析，特别是连续工艺操作，对包括上游批次和灌流工艺、下游批次和连续层析等方法进行了概述，同时介绍了现有可用于经济性分析的模拟软件包和方法。本文为原文主要内容简介，详细内容请参考原文。

生物制品操作

生物药的生产过程通常分为两个部分：上游和下游，主要以批次模式运行。生产规模的范围从实验室到商品化生产规模。生物药生产包括三个阶段：临床前、临床和商品化生产。在研发的早期，生产量较小（g），但在治疗性蛋白质的开发进程中，需要生产数公斤的产品，以支持不同的操作，包括临床试验。当项目进入商品化后，可能需要吨级的产品以满足需求，特别是一些“重磅”产品。但也有一些用于罕见病的特定生物制品，如一些酶，其商品化生产规模有限，批次体积会显著降低。

与批次工艺不同的是，连续工艺虽尚未被广泛采用或明确定义，但过去一段时间来，已成为行业的热点，也是未来生物制药生产工艺最有潜力的发展趋势。下表为FDA对不同操作模式的定义。

不同操作模式的定义 (O.Yang, et al.,2019).

在治疗性蛋白质生产中，宿主细胞用于表达目的蛋白，所用宿主细胞的选择会显著影响工艺设计。宿主细胞包括微生物（如酵母和大肠杆菌)、哺乳动物细胞(如CHO和NS0细胞)或转基因生物(如植物细胞)。宿主细胞的蛋白质表达可以发生在胞内，原核细胞一般是这种情况。胞内表达通常需要裂解细胞，以释放蛋白质，特定情况下，需要进行蛋白质重折叠（复性），以维持正确的构型。另一方面，在哺乳动物细胞中，蛋白质表达通常经设计会发生在胞外。宿主和培养基中存在不同类型的产物和工艺相关杂质，如DNA、不需要的蛋白质以及废弃的生长培养基。杂质通过生产工艺过程去除，且因产品而异。下图所示为使用胞内和胞外表达的生物药生产工艺的一般流程图。

生物药生产工艺的一般流程图 (O.Yang, et al.,2019).

在上游操作中，微生物和哺乳动物细胞在生物反应器或发酵罐内培养。在下游中，所有工艺都需要应用离子交换方法，以进行蛋白质纯化。过去几年来，在三种宿主选择中，哺乳动物细胞成为最有竞争力的方法，因为CHO生产蛋白质的翻译后修饰特性最能反映人源蛋白质特性，所有具有优化的活性，降低因免疫原性的发生而导致的负作用，进而形成良好的PK/PD特性。以批次或连续操作进行的哺乳动物细胞mAb生产均有开发。

以批次或连续操作进行的哺乳动物细胞mAb生产的流程图(O.Yang, et al.,2019). 在连续操作中，如使用基于中空纤维的灌流技术进行细胞培养，可省略澄清步骤，直接上样至捕获步骤。

在上游哺乳动物mAb生产中，通常有两个步骤：首先，接种和培养，也称为种子扩增，其在种子生物反应器内进行，然后，在生产生物反应器内进行细胞培养生产。有4种类型的细胞培养条件被用于上游mAb生产：批次、补料分批、浓缩补料分批和灌流生物反应器。生物制药工艺通常使用体积5,000-25,000L的批次或补料分批生物反应器，培养时间10-17天。产物蛋白质的滴度一般为1-5g/L，但也有达到10-13g/L的报导。浓缩补料分批和灌流生物反应器操作时，连续补加新鲜培养基，并去除耗竭的培养基，以维持高细胞密度和长期的培养工艺。在浓缩补料分批生物反应器的情况中，仅耗竭的培养基被从生物反应器去除，而蛋白质和细胞被截留在生物反应器内。所以，该工艺的滴度可达到25-30g/L，与浓缩补料分批不同的是，灌流生物反应器仅将细胞截留在生物反应器内，而蛋白质随废弃的培养基进入滤液。所以，灌流工艺可用于连续蛋白质生产，并在特定条件下达到长期稳态化的细胞生长。为将细胞保留在灌流生物反应器内，需要使用细胞截留装置。细胞截留可置于灌流生物反应器内部或外部，内置装置包括旋转滤器等，而外置细胞截留装置包括重力沉降、超声沉降、切向流过滤（TFF）和交替式切向流过滤（ATF）。在ATF灌流系统中，细胞密度可在稳态条件下达到130 x 10^6cells/mL或以上。浓缩补料分批主要以超滤式细胞截留装置操作。基于灌流液的纯度水平，随后的下游工艺可能需要额外的过滤步骤，也可省去澄清过滤步骤，如使用TFF或ATF时。种子生物反应器可以是批次、补料分批或灌流生物反应器。在此操作中，灌流种子生物反应器的目标不是进行连续生产，而是为生产生物反应器提供更高的细胞浓度。

下游工艺通常从澄清步骤开始，但一些工艺会把这一步作为上游操作考虑。传统上，在批次工艺中，离心结合深层过滤的方法最为常见。而在连续操作中，澄清步骤已包括在反应器的灌流培养中。此外，絮凝和沉淀均是可以用于批次和连续澄清步骤的方法，以降低杂质。澄清步骤之后为初步捕获步骤，Protein A层析被广泛用于传统的批次生产，以去除宿主细胞蛋白、DNA及其它杂质。目前也开发有非层析的工艺，如以批次模式进行的ATPS。几年来，还开发了多种用于初步捕获的连续或半连续方法，包括周期性逆流层析（PCC）、多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）、连续逆流切向层析（CCTC）以及连续沉淀工艺。初步捕获后通常是病毒灭活单元操作。在此步骤中，捕获步骤的洗脱液暴露于低pH条件，以灭活病毒。在批次工艺中，该步骤使用混合罐进行孵育然后中和。在连续操作中，开发的方法包括使用平行或串联设置的多个病毒灭活罐，使用静态混合器或使用直管反应器、活塞流反应器、或螺旋流逆变器，以实现连续的病毒灭活。产物额外的纯化，也称为精制，通过离子交换层析、疏水层析或两者结合来进行。在批次工艺中，精制步骤通常以结合/洗脱或流穿模式进行。使用多柱模式，这些方法可实现连续化。此外，其它方法，或模拟移动床（SMB）层析、六-、三-及两-柱MCSGP工艺、环形层析、径向流层析、蛋白质结晶以及切向流过滤也可用于连续纯化步骤。对于连续除病毒过滤，可使用交替运行两个除病毒过滤器。药物底物（API）生产的最后一步是制剂步骤，包括缓冲液置换和蛋白质浓缩。相较传统工艺，可使用单通过切向流过滤（SPTFF）、级联洗滤、逆流分段过滤以及结晶来实现连续蛋白质生产。

对于微生物表达，批次和补料分批培养均可用于上游生产。基于微生物的上游操作的持续时间通常比基于哺乳动物的操作要短得多。为实现连续的微生物操作工艺，灌流液中产物连续收获。灌流培养和废弃液流都是可行的生产替代方法。胞内产物的的下游工艺相比胞外产物更加复杂，因为生产料液中所含的杂质更多。相比澄清后直接进行后续纯化，胞内生产时，细胞需进行裂解，并去除细胞碎片。纯化步骤也与哺乳动物/胞外产物不同，因为可能需要变/复性步骤。连续的碟片式离心机可以用于连续的细胞收获。进行连续的均质操作时，可串联安装两台均质机，以实现连续的细胞裂解。使用中空纤维过滤器进行连续化学裂解也是一种可行的替代方法。下游的复性工艺也可以通过使用桨式反应器、CSTR、环形和模拟移动床层析或以连续模式操作的膨胀床转化为连续工艺。

整合式连续工艺操作模型构建、经济性分析方法及影响因素等内容，请参考原文

讨论

经济性分析已经被用于生物制品生产设施中的工艺评估、优化以及决策确定。在传统生物药生产中，种子罐通常用于生产罐之前的接种和扩增。种子罐可以是批次、补料分批或灌流生物反应器。在批次和补料分批生物反应器中维持高细胞密度，从技术上来讲存在不小挑战，这会进而影响生产罐内的产物质量和操作时间。灌流生物反应器可维持更高的细胞密度，这已被证实在生产阶段具有潜在的优势。Yang等证实，在生产罐之前，使用配有ATF细胞截留装置的灌流种子扩增罐，可将CHO上游批次工艺的蛋白质生产周期从17天缩短至12天。对于连续生产生物反应器的开发，现有的大多数文章都聚焦于哺乳动物细胞培养，因其是抗体生产中最常使用的方法，且下游工艺方案最简单。但是，生物药工艺中仍存在连续的原核蛋白质生产方式。此外，上游工艺需要严格的细胞培养条件，以维持所需的产物质量。此外，为维持连续操作中的长期细胞培养，在生产线设计和经济分析中，灌流生物反应器的动态控制是一个重要考量因素。

随着下游工艺的发展，目前市面上已有针对每个单元操作的替代方法。但是，对不同方法的分析和比较却较少受到关注。相比连续沉淀，周期性逆流层析系统可达到较高的产量。但是，这种工艺采用半连续操作模式，较难实现稳态，因为洗脱液中的浓度会随时间变化。但需要指出的是，这种方法似乎在下游连续操作中最常使用。相比传统的批次层析，优化的连续逆流切向层析方法可提高产量和产率，同时降低蛋白质聚集，而维持所获产物中与传统技术相当的污染物去除水平。此外，需要开发更加先进的工艺分析技术（PAT）、质量源于设计（QbD）、多变量数据分析（MVDA），以利用其实现直接且实时的药物检测以及生物制品生产。下游工艺还需考虑病毒安全性以及制剂缓冲液，以实现稳健的连续生产工艺。

整合式连续工艺操作的经济可行性，特别是从经济可行性角度与不同操作模式的比较没有得到非常多的关注。批次和连续工艺的比较主要集中在关键操作步骤上。两种生产模式之间的缓冲液制备、工艺自动化和控制、在线处理等都有较大的差别，需要纳入考量范围。连续工艺缓冲液制备方法的成本评估、自动化的成本、批次和连续工艺操作系统复杂性的不同均是影响工艺总成本的重要因素。缓冲液制备中使用的储罐的数量会影响厂房成本以及劳动力成本。

CIP（在线清洗）包括CIP缓冲液以及非工艺用水会影响物料成本，且会造成环境影响。SIP（在线灭菌）会影响工艺系统的能源消耗以及用水。所使用的SIP和CIP站的数量也需计入设备成本。在连续工艺操作中，由于进行的批次运行数量更少，所以可降低CIP和SIP操作。此外，一次性使用系统消除了CIP和SIP工作站的使用，也可降低整体的成本。在上游工艺中，搅拌罐生物反应器的CIP用水量被认为一般是反应器体积的4倍。一次性使用系统也可以降低因CIP/SIP操作、安装和维护而导致的失败几率。在工艺设计过程中，CIP和SIP站使用的数量会影响工艺的日程计划，因为不同的单元操作可能分享相同的CIP/SIP工作站。此外，加入更多的工艺设施细节后，如辅助系统，生产线的设计将更接近现实，经济性分析也会更准确。

进行经济性分析的现有软件一般包括模拟软件和编程方法。模拟软件，如BioSolve、SuperPro和Aspen，相对用户友好，更容易被行业采用。但是，除Aspen Dynamics外，现有的软件包通常仅限于稳态模拟，相比编程模型，灵活性较低。使用Aspen模拟软件仅能对连续工艺系统的下游分离工艺进行建模。为对生物药工艺进行建模，GAMS、MATLAB和其它一些建模软件可用于对连续生产进行建模，特别是可用于实现工艺优化。

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本文为下文摘要，文中图、表中内容为小编翻译，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。

原文：O.Yang, M.Qadan, M.Ierapetritou, Econmic Analysis of Batch and Continuous Biopharmaceutical Antibody Production: a review. Journal of Pharmaceutical Innovation. 2019, https://doi.org/10.1007/s12247-018-09370-4.

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