使用基于ATF的补料分批/灌流混合工艺进行病毒疫苗生产

来自德国马克斯·普朗克复杂技术系统动力学研究所和ProBioGen AG等的科学家们在2019年第103期的《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上发表了题为“High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system”的文章。文中，研究人员提出了一种在高细胞密度工艺中提高MVA（修饰的安卡拉痘苗病毒）产率的培养策略。该策略基于此前研究人员在摇瓶培养中开发的方法，在台式生物反应器中建立，包括AGE1.CR.plX细胞在化学限定培养基中悬浮培养至高细胞密度，然后以MVA-CR19病毒株感染。首先，建立灌流策略，以优化细胞生长阶段。其次，初始感染阶段选择补料分批策略，以促进病毒摄入和细胞间的传播。最后，再切换为灌流，为病毒增殖晚期连续提供营养物。该补料分批/灌流混合策略获得最大感染性滴度为1.0 x 10^10 IU/mL，相比传统批次培养，产物滴度可提高一个数量级。最后，从生产灭活疫苗考虑，将该策略用于生产流感A/PR/8/3（H1N1）病毒，使用相同的培养系统，可达到3.8 × 10^10 virions/mL的总数。总体来讲，使用相同的系统，可获得与传统批次培养相当或更高的细胞特异性病毒产量和单位体积产率。此外，大多数病毒颗粒在培养上清中，可简化下游操作，特别是MVA病毒。研究人员总结认为该策略有助于新的病毒疫苗生产方法的开发。以下为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

修饰的安卡拉痘苗病毒（MVA）是一种高度衰减的痘病毒，具有作为载体疫苗的潜力。在人类受体中，MVA可启动、但不能完成完整的复制周期，即具有与活病毒疫苗相似的免疫源性，且具有与灭活病毒疫苗相似的安全特性。表达不同病毒性异源抗原的MVA重组体已在临床前或临床测试中。传统上，用于免疫的MVA重组体的大规模生产依赖于在鸡胚成纤维细胞（CEF）中的增殖，但由于为大规模生产提供原代细胞培养非常具有挑战性，所以很多研究关注使用连续悬浮细胞系进行生产。

流感病毒通常经处理后用于提供针对季节性流感的灭活疫苗。在过去70年中，流感疫苗的生产依赖于鸡胚。这种方式的缺点是需要使用动物源性的底物，且可能面临鸡胚供应短缺的问题，特别是出现大流行的紧急情况时。最近，FDA批准了两种基于细胞培养的疫苗，其分别使用MDCK细胞和基于杆状病毒表达载体系统的昆虫细胞。

基于细胞培养的病毒疫苗生产通常由两个阶段组成，包括起始的细胞生长阶段以及种子病毒接种后启动的病毒复制阶段。病毒基因组扩增、病毒蛋白生产后，组装形成病毒子，释放后代病毒颗粒。一般情况下，细胞先以批次模式培养，在对数生长期后期感染，此时浓度一般为10^5-10^6cells/mL，感染时置换部分培养基或不置换。

放大且强化的工艺可为确保疫苗足量供应提供所需的高生产滴度。对于MVA来说，其需要高病毒滴度，因其不能在人类受体中复制，所以不能在注射位点扩增。对于流感病毒来说，工艺需要强化，因为多价疫苗的组成每年都在变化，且季节性病毒株选择和开始疫苗接种之间的时间非常短。

提高宿主细胞浓度是强化生物制品生产工艺的标准方法。高细胞密度（HCD）工艺可允许使用紧凑型生物反应器，而获得高单位体积产率，活细胞密度可调节至10^7-10^8cells/mL。该细胞密度可通过连续灌流模式达到，其可连续补加新鲜的培养基，并去除毒性副产物（如乳酸和氨），而将细胞截留在生物反应器内。以灌流模式进行的重组蛋白生产通常以高培养基置换率进行，如1-3vvd或0.05-0.5nL/cell/day。为在恒定的高细胞密度条件下，将培养维持在增殖状态，需控制性地从生物反应器连续去除细胞，即所谓的细胞废弃（cell - bleeding），新的培养策略，如n-1灌流/高密度接种补料分批、浓缩补料分批（CFB）以及灌流/补料分批混合策略被开发用于降低培养基使用，同时维持细胞特异性以及单位体积产率，并保证一致的产物质量。

研究人员此前在摇瓶中对几种培养策略进行了详细的分析，结果显示，补料分批阶段之后每日置换90%的培养基，可同时提高细胞特异性和单位体积产率，超过对照组的传统细胞密度工艺。基于此，本文在受控的放大培养系统中开发了一种优化的HCD工艺，以提供所需的高病毒产量。

实验

生物反应器培养

CR.pIX细胞以0.8-10^6cells/mL的密度接种1L 台式生物反应器（BIOSTAT B plus，Sartorius AG），工作体积0.6-0.8L。生物反应器操作条件设置为37℃、pH 7.2、搅拌速度 120-160rpm，以20μm微泡控制DO为40%。细胞开始以批次模式培养，当葡萄糖浓度达到14-17mM时（接种后60-72h），开始灌流。灌流使用ATF2系统，以C24控制器控制，流速设置为1.0L/min，并以确定的灌流速率进行操作，以达到＞25 x 10^6cells/mL的细胞密度。

在细胞生长阶段，灌流速率每12或24h手动调节。操作时，离线检测活细胞密度，计算取样时间点的相应流速，确保CSPR为0.06nL/cell/day，这是CR.pIX细胞基于其葡萄糖消耗速率的最佳置换速率。根据最高细胞特异性生长速率μ=0.026h-1，计算12或24h后的预期活细胞密度和相应的灌流速率。使用BIOSTAT B plus模块的级联控制，可获得采样时间点之间的线性曲线。感染前2h，使用ATF系统，以新鲜培养基置换1个反应器体积。

培养置换后，生物反应器感染MVA-C19或流感A病毒A/PR/8/34（H1N1）。对于MVA-CR19病毒，使用2种补液程序加上灌流程序，命名为混合工艺1和混合工艺2，以优化在高细胞密度条件下的病毒增殖。对于混合工艺1，废弃部分细胞悬液，以0.3L的细胞悬液开始病毒生产阶段。病毒感染后，加入0.15L新鲜培养基，立即开始补料分批，在感染后12h再补液0.15L，感染后24小时，补液0.3L。最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率进行灌流。病毒颗粒（200-400 nm）使用与细胞生长阶段相同的ATF中空纤维组件进行收获。相似的，对于混合工艺2，在病毒感染后立即补液0.2L，之后在感染后24h，补液0.25L，最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率进行灌流。为提高病毒收获，在感染后36小时，将细胞生长阶段使用的0.2μm中空纤维组件替换为新的更大孔径组件。对于流感病毒A生产，评估了一种与MVA-CR19病毒相似的混合策略。

详细实验操作及结果，请参考原文。

结果与讨论

文中实验在1L生物反应器上配置ATF灌流系统，控制灌流操作，以达到HCD培养。灌流速率基于固定的细胞特异性灌流速率（CSPR）进行调节，其指每天提供给单个细胞的培养基体积。在病毒生产阶段，细胞以补料分批模式培养，之后使用与用于细胞增殖阶段相同的ATF灌流系统连续置换培养基（补料分批/灌流混合策略）。该工艺的产量和产率确认了摇瓶实验的结果。为研究这种策略在其它病毒疫苗生产工艺中的适用性，测试了流感A病毒的增殖，结果显示可获得与传统细胞密度培养相似甚至更高的产率。

在病毒疫苗生产中使用HCD策略进行工艺强化可帮助确保疫苗的稳定供应。在已经建立的传统批次生产工艺基础上，HCD策略的执行可显著提高生产能力。本文介绍了一种在搅拌罐生物反应器中，用于MVA和流感A病毒生产阶段的补料分批/灌流混合策略。该策略的应用可使病毒滴度提高7-20倍，而不影响细胞特异性和单位体积产率。MVA病毒获得的10^10 IU/mL高滴度的结果证实，该方法可替代当前依赖于原代鸡胚成纤维细胞作为底物的技术。而实验中两种不同病毒达到的结果，也可作为将传统病毒疫苗生产方法进行现代化升级的指南。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：D.Vazquez-Ramirez, I.Jordan, V.Sandig, High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 3025-3035.

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