通过连续生物工艺建模，加速生物生产

来自德国克劳斯塔尔理工大学的科学家们在2019年第7期的《Processes》杂志上发表了题为“Accelerating Biomanufacturing by Modeling of Continuous Bioprocessing - Piloting Case Study of Monoclonal Antibody Manufacturing”的文章。文中，研究人员对基于CHO细胞的、产量1 L/天细胞上清液，即约150g/年产物（单克隆抗体）的中试规模连续生物工艺进行了可行性实验研究和模型验证。实验时长约6周，包括准备、启动、批次及维持至少两周的连续稳态操作和纯度及产量的最终分析。实验在使用交替式切向流过滤（ATF）进行灌流培养之后，成功进行了包括水两相提取（ATPE）、超滤/洗滤（UF/DF）、含离子交换（IEX）和疏水作用（HIC）柱的的整合式逆流层析（iCCC）纯化以及冻干的连续工艺处理。实验及建模证实，连续操作稳定且可行。下文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

当前单克隆抗体的生产主要基于批次平台工艺，其可分为上游和下游工艺，上游生产基于在生物反应器内的细胞培养，而下游工艺的目的是使用诸如离心、过滤和层析等方法，从宿主细胞蛋白、DNA、培养基成分、病毒以及内毒素等成分中分离目的产物。平台化工艺包括体积可高达20,000L的生物反应器哺乳动物细胞补料分批悬浮培养，以及后续的收获澄清、捕获层析、中间体纯化及精制、病毒灭活等单元操作。为评估每个单元操作，需对特定的参数进行表征，包括分辨率、速度、载量和回收率，而根据分离任务的不同，特定单元操作的主要目的会有差别。但由于上游工艺优化而不断提高的产品浓度，目前已建立的平台工艺，特别是下游单元操作，多数已达到或将达到其载量极限，产物浓度的增加已开始将产品的主要成本从上游向下游的转移。

连续生物工艺可通过提高每个单元操作的产率和灵活性，而绕过下游瓶颈和批次规模放大问题，同时，由于连续的产品处理，即更短的滞留时间，可提高产品质量。FDA、EMA和ICH以及多个行业工作组已开始发布指南，旨在提高生产过程中产品质量，进而促进连续生物工艺。有研究指出，这种产率的提高可使整体特异性产品成本降低约88%。

针对单克隆抗体生产的批次和连续操作模式的系统性成本比较（M.Kornecki, et al., 2019）。

原文研究人员旨在通过案例研究，证实在工业环境中实现连续生物工艺的可行性，同时突出需要解决的挑战（如无菌性、操作成本以及工艺开发）。本文主要介绍在实现连续工艺过程中，作为上游“唯一”可行方法 - 细胞灌流培养的执行。 

替代性连续工艺的开发

在工艺开发方面，通过针对每个单元操作引入风险评估，并以工艺建模和实验设计（DoE）进行支持，可建立良好的工艺设计空间。针对基于工艺分析技术（PAT）的先进工艺控制的控制策略的开发，对于每个单元操作的稳健自动化至关重要，有利于实现全局性的工艺优化。执行PAT技术获得的额外数据可保证工艺进一步优化以及获得先进控制策略的可能性。

在细胞培养过程中，针对PAT方法的重要属性包括工艺参数（如气体流量、pH、pO2）和变量（如底物/代谢物/产品浓度、生物质/活性）。整体目标是控制关键工艺参数（CPP），因其可影响细胞生长速率、产物生产速率、宿主细胞蛋白和代谢物以及产品质量（如翻译后修饰、结构和效价）。所以，对于高效、控制良好且稳健的生物工艺来说，生物反应器的实时监测必不可少。

所有单元操作都预先从其它工艺步骤中分离出来进行测试。之后，需要1-2周的预培养和启动。经过5天批次启动后，达到向稳定灌流操作转移的点，并维持1周以上。实验进行了总共两周的连续操作。平行进行分析，所有数据包的分析需要3周时间，当然，后者可通过采用合适的工艺分析技术（PAT）方法而降低。

单克隆抗体连续生产工艺流程表（M.Kornecki, et al., 2019）。

细胞培养

使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO DG44）生产单克隆抗体。培养条件为36.8℃、pH 7.1、60% pO2、433rpm，培养在Sartorius Biostat B 2L生物反应器内进行，使用无血清化学限定培养基。

对于连续培养，使用交替式切向流过滤（ATF）灌流系统，进行细胞截留。灌流在活细胞密度达到2x10^6cells/mL时开始。在整个连续培养过程中维持体积置换率为1VVD。通过原位浊度探针，将活细胞浓度维持恒定为特定细胞浓度。

灌流培养示意图如下图所示。在高活性时（＞95%），浊度可用于在线监测活细胞浓度。所以，使用在线浊度阈值来进行在线控制。操作点（4800FAU）被选择用于活细胞浓度控制，其代表的活细胞浓度为25x10^6cells/mL。当浊度超过阈值时，自动触发废弃（bleeding）泵。滤液和废弃液流速之和等于补液流速，以维持培养体积。ATF泵置换体积为80.14mL，当其以每分钟1个泵循环运行时（一个循环定义为真空排气并加压置换整个泵体积），ATF流速为160 ml/min，此时可达到ATF比例为200.35（滤液体积流速和ATF流速之比）。

恒浊灌流培养的系统示意图，包括通过浊度、补液和废弃泵进行活细胞浓度控制的控制策略（M.Kornecki, et al., 2019）。

灌流培养达到的抗体浓度为0.34±0.05g/L（批次阶段结束时）、0.70±0.06g/L（稳态开始时）以及0.50±0.03g/L（培养240小时时）。较低的产物浓度是由于相比传统灌流培养（14-60天），实验中工艺的培养时间较短。但是，即使在较低的产物浓度条件下，单位体积产量仍达到了700.34±56.85mg/L/d（稳态开始时）和503.20±28.45mg/L/d（培养240小时时）。高产率以及其它工艺特性（如更低的投资支出、长期的连续培养）增加了灌流系统的吸引力。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：M.Kornecki, A.Schmidt, L.Lohmann, et al., Accelerating Biomanufacturing by Modeling of Continuous Bioprocessing - Piloting Case Study of Monoclonal Antibody Manufacturing. Processes, 2019, 7, doi:10.3390/pr7080495.

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