用于疫苗和基因治疗的优化的病毒纯化工艺：收获、澄清、浓缩

收获

纯化流程的第一步受生物反应器料液的影响较大，包括细胞密度、活性以及产物的释放形式，如出芽分泌或细胞裂解。对于裂解病毒生产，如腺病毒（AV）或腺相关病毒（AAV），病毒颗粒收获时，需收集胞内和胞外馏分，一些因素可用于确定最佳收获时间，如工艺可重复性、胞外病毒稳定性以及后续纯化工艺要求。细胞裂解可使用不同的方法，如冻融、均质或超声。

尽管细胞裂解后可收获胞内病毒，但同时也会释放宿主细胞DNA和蛋白质，必需从终产物中去除。宿主细胞DNA是一个重要的考量因素，不仅因为其会大幅度增加料液的粘度，更重要的是相关的法规要求，例如根据产品类型、医学指征、生产宿主和用药周期的不同，可接受的DNA水平在每剂10ng-10pg，大小低于200碱基对。而囊膜病毒，如逆转录病毒、杆状病毒、慢病毒、流感病毒或囊膜VLP不需要细胞裂解，因为病毒可通过生产细胞的出芽过程分泌。对于宿主DNA，一般可使用核酸酶孵育步骤去除，其可与细胞裂解同时进行或在澄清后进行，另外也可以使用选择性沉淀法替代核酸酶处理，沉淀的DNA可通过深层过滤去除。

澄清

合适的澄清步骤需能有效去除细胞碎片和较大的聚集物（产品或工艺相关），同时维持并保护工艺料液中产品的质量，特别是生物反应器料液是基于微载体时，细胞碎片和微载体需在此步去除，但此类细胞培养的细胞密度通常不高，所以，相对来说，更具挑战是的悬浮细胞培养，特别是使用可达到极高细胞密度的灌流系统时。澄清的最终目的是使生物反应器来料适于更下游的处理步骤，如层析和超滤。离心和膜微滤（包括死端或切向流过滤）是最常用的两种操作模式。

离心是实验室规模常用的生物反应器料液澄清方法，而连续流离心是工艺规模的常规选择，但只有碟片式离心机可按半连续模式操作，其工作时连续补充悬液，澄清后料液连续清除，固体间断性取出。离心后的料液通常还需要进行深层过滤，以清除较小的残留颗粒。离心机的可放大性，对于工艺的优化和采用特别重要，也是目前该技术的限制因素之一，另外还包括较高的成本投入。

所以，更多情况下，倾向于使用膜微滤技术，因其更易规模放大，并按cGMP要求进行。过滤膜孔径范围为0.1-10μm，根据固体颗粒的截留方式，可分类为深层过滤，或“常规”过滤器。深层过滤器可能还需要使用助滤剂，如硅藻土，以修饰其结构和电荷。深层过滤器已广泛应用于多种VLP和病毒（囊膜或无囊膜）。

切向流过滤（TFF）是另一种常用的膜微滤模式，此时，膜表面的“错流”会形成“清扫作用”，避免或缓减浓差极化和凝胶层形成。膜微滤/超滤一般在恒定跨膜压条件下进行，但在有些工艺实践中，也会使用恒定滤液流速或恒定滤液压力，这通常在比较不利的条件下选用，如截留物质在膜表面形成较高浓度时，导致污染增加或产品质量劣化。TFF用于澄清时，通常在低压条件下进行（如<0.7bar）。

上游工艺技术的发展提高了细胞密度和产物滴度，这增加了对上述技术的挑战。有报道称，用于HIV疫苗候选物生产时，PER.C6细胞系可达到10^8cells/mL，感染流感病毒的MDCK可达到50x10^6活细胞密度。两个实验都使用了新型ATF灌流系统。

浓缩

超滤（UF）是所有大规模生物工艺中的关键操作，其可处理大体积的料液，如达2千升的疫苗和2万升的单抗，特别是在进一步的层析处理前，进行10-100倍的浓缩。病毒料液体积性浓缩和缓冲液置换的关键性不仅在于获得适合高滴度病毒载体的缓冲液体系，还在于降低操作体积，以利于加快下游工艺，将纯化工艺的规模维持在可控的水平。

超滤是压力驱动的分离工艺，使用截留分子量（MWCO）0.65-750kD的多孔膜。超滤膜通常由两层组成：较厚的大孔支持层和较薄的皮层，前者提供机械强度，后者保证膜选择性和渗透性。

超滤膜的选择通常要求可截留目的产物，而允许杂质通过膜，进入滤液侧。超滤的浓缩进样悬液为截留馏分，而不在滤液中，超滤过程中，通过向进样容器中补加缓冲液，以置换产物原有缓冲液的过程称为洗滤，在该过程中，使用超滤膜可去除、置换或降低原始溶液中的盐或溶剂的浓度。如果缓冲液添加的速度与滤液流出的速度一致，且没有膜截留，介质中给定成分的浓度会呈指数性降低。当然，也可以使用控制更为简单的批量式洗滤。

在大多数病毒载体下游工艺中，超滤膜通常以恒定跨膜压的模式操作，通常使用的跨膜压为0.5-1.4bar，而最佳错流流速会因病毒颗粒的结构稳定性而有较大差异：有囊膜病毒相比无囊膜病毒更脆弱，更易因剪切而损坏，所以前者更多选择液流模式更加温和的中空纤维过滤器，而对于后者，选择中空纤维或平板膜包的工艺均有报道。

此外，超滤和微滤，不管是中空纤维或平板膜包，均可按可抛弃型模式使用，其从实验室到生产的规模放大不需要太复杂的优化过程。病毒超滤使用的膜MWCO一般为100 - 750kD，病毒收率一般在70-85%。理想的超滤膜应具有较高的分离选择性，从而获得更高的产物截留，但同时也需具有极高的渗透性，以提高通量，缩短处理时间。

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原文：P.Nestola, C.Peixoto, R.R.J.S.Silva, et al., Improved Virus Purificaiton Processes for Vaccines and Gene Therapy. Biotechnology and Bioengineering, 2015, DOI 10.1002/bit.25545.

J.O.Josefsberg, B.Buckland, Vaccine Process Technolgy. Biotechnology and Bioengineering, 2012, DOI 10.1002/bit.24493.

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