灌流细胞培养可降低偶联融合蛋白裁剪和质量异质性

来自瑞士Merck Biopharma和苏黎世联邦理工学院的科学家们在2019年第302期的《Journal of Biotechnology》杂志上发表了题为“Perfusion cell culture for the production of conjugated recombinant fusion proteins reduces clipping and quality heterogeneity compared to batch mode processes”的文章。作者指出，用于治疗性重组蛋白生产的灌流细胞培养技术正越来越普及，以实现针对不同应用目的的工艺强化，在原文实验中，研究人员以双特异性偶联融合蛋白为模型，比较了三种不同操作模式：低接种密度（LS）的传统补料分批、使用高细胞密度接种（HS）的补料分批以及灌流生产生物反应器。结果显示，相比LS补料分批，使用HS和灌流生物反应器，每日单位体积产量分别提高了3倍和7倍。灌流操作也有益于关键质量属性（CQA），特别是，相比补料分批操作，裁剪的水平，即融合蛋白的片段化，显著降低。在灌流中，裁剪水平在0.6-1.5%之间，而在补料分批（LS和HS）中，该水平分别可达到8.7和4.9%。使用灌流还可降低聚体水平，电荷异构体分布更加均一。总结来说，对于双特异性偶联融合蛋白的生产，结合灌流技术的连续工艺具有产量和质量方面的天然优势。本文为原文简介，详细内容，请参考原文。

简介

单克隆抗体是最成功的治疗性重组蛋白，而目前新的发展方向包括药物偶联物、双特异性抗体或融合蛋白以及其它抗体形式。对于偶联的蛋白质，其作用方式是触发或阻断两种代谢通路，以获得已知机制的协同效应。为了不断地提高治疗效力，生物制药行业正在向更加复杂的蛋白质构型方向发展，而另一方面，现代化的生物制药蓝景需要更加灵活且强化的生产能力。当前开发的工艺强化策略主要使用连续生产方案。对于工艺的细胞培养部分，通常使用灌流操作，以提高细胞库生物质、操作n-1种子罐以实现生产罐高密度接种或以不同的方式支持补料分批工艺。灌流现在被认为是一种可与连续纯化操作相结合的可行、可用生产单元。

实验

研究使用一个双特异性融合蛋白为模型，其组成包括一个单克隆抗体，C-端融合至另一个结合蛋白，已知这两部分在生产过程中容易被裁剪，进而破坏最终药物产品的协同作用。

融合蛋白结构图示，显示重链（HC）、轻链（LC）、连接体和融合的蛋白。裁剪会从mAb上分离融合的蛋白质，导致生物学功能的丢失（J.Bielser, et al., 2019)。

实验使用生产该融合蛋白的CHO-K1细胞系，比较了使用低（LS，0.2x10^6cells/mL）和高（HS，9x10^6cells/mL）细胞密度接种的补料分批工艺和灌流生产工艺的结果，包括三种不同操作模式的产量以及产物质量属性，如裁剪、聚集、电荷异构体以及糖基化。

低（LS）和高（HS）密度接种补料分批以及灌流（PF）模式中n-1和生产阶段的细胞密度图示（J.Bielser, et al., 2019)。

详细实验操作和检测分析，请参考原文。

高密度接种补料分批：用于高密度接种的n-1细胞培养使用灌流操作5天，最高灌流速率3 VVD，最终细胞密度为30 x 10^6cells/mL。补料分批生产生物反应器接种密度为9 x 10^6cells/mL。该策略的目的是缩短n-阶段工艺的持续时间，同时相比低密度接种补料分批，使滴度翻倍。基于该目的，运行在第9天停止。

灌流：灌流生物反应器接种密度0.5 x 10^6cells/mL，培养第3天开始灌流，灌流速率设置为1 VVD。通过称量，控制培养基补液流速，同时通过控制收获液流速，维持生物反应器重量恒定，并以在线电容信号控制废弃液（bleeding）流速。设定点的设置基于此前确定的该细胞系在实验培养基组成条件下的CSPRmin。细胞截留设备使用实验室规模交替式切向流过滤设备XCell ATF 2，配用孔径0.2μm的聚醚砜中空纤维过滤器。

结果与讨论

灌流操作模式可用于n-1生物反应器，以提高补料分批生产生物反应器的接种密度，也可以直接用于生产步骤。在两种操作中，达到的细胞密度都显著高于传统补料分批。在考量的案例中，HS的最终滴度达到LS滴度的两倍以上，而运行时间缩短了5天，从生物反应器利用率和产率方面考虑，优势明显。从产物质量考虑，两种补料分批工艺的结果相似，但由于工艺时间降低，HS操作中的裁剪水平更低。

达到稳态后，灌流生物反应器中生产的蛋白质浓度为10.1g/L，每日单位体积产量为0.67g/L/day，而LS和HS的每日单位体积产量分别为0.09g/L/day和0.34g/L/day，灌流对工艺强化的效果明显。

从产物质量属性来看，灌流中检测到的裁剪水平更低，这是一个非常明显的优势，原因一方面是产物在生物反应器内更短的滞留时间，另一方面是灌流中更高的细胞活性，即意味着更少的蛋白酶释放。另外，灌流模式中的聚体水平也更低，且由于滞留时间的降低，可获得更多的主要电荷异构体形式。

低（LS）和高（HS）密度接种补料分批以及灌流（PF）模式中的活细胞密度、活性、滴度和融合蛋白裁剪水平比较（J.Bielser, et al., 2019)。

以上讨论的实验结果证实，在生产工艺的整个生命周期中，从早期开发到其在商品化规模中的执行，生物反应器操作模式的选择会有很大的后续影响。灌流在单位体积产量和产物均质性方面具有更加出色的变现。下一代的生物药生产可能可以利用这些特点，以提高生产的效率和灵活性，同时获得更好的产物质量。在完全整合的连续生物生产中，将灌流与连续下游工艺连接，可发挥协同作用的全部优势。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：J.Bielser, L.Chappuis, Y.Xiao, et al., Perfusion cell culture for the production of conjugated recombinant fusion proteins reduces clipping and quality heterogeneity compared to batch mode processes. Journal of Biotechnology, 2019, 302: 26-31.

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