病毒载体生产：如何满足当前和未来的需求？

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

来自加拿大国家研究委员会人类健康治疗研究中心等的科学家们在2019年第5期的《Cell & Gene Therapy Insights》上发表了题为“Viral vector manufacturing: how to address current and future demands?”的文章。作者指出，稳健且经济的病毒载体生产是细胞和基因治疗商品化的核心挑战之一，本文，他们评估了当前病毒载体工艺生产技术对于满足预期需求的适用性，并特别关注腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）以及生产中最常使用的细胞类型 - 人胚胎肾（HEK）293细胞系，并总结认为，尽管在病毒载体生产中会看到不同的混合生产技术，但是基于悬浮培养的上游工艺将成为行业的标准，而且在未来几年，连续生物工艺将有可能改变该领域，从而大幅降低生产成本。本文为原文内容简介，详细内容，请查看原文。

基于病毒载体的治疗方案

使用病毒载体的产品和治疗方案可根据其给药方式分成两类：体内或体外递送。体内治疗方案需将病毒载体直接注入患者体内，药物产品为经工程改造的病毒，其携带治疗性转基因，并在体内恢复靶细胞功能。对于此类治疗，一个药物产品（即病毒载体，且大多数情况下基于AAV）批次理论上可以治疗大量的患者。体外方案基于病毒载体修饰的细胞，如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫治疗，在这种治疗方式中，经工程改造的细胞被用于修饰患者细胞。药物产品为修饰的细胞（所以，大多数情况下，每个患者为一个批次），病毒载体是GMP生产的起始材料（一个大批次可为多个患者细胞的修饰提供物料）。

由于不同应用和适应症的差异，对病毒载体的需求可能会因为治疗方案以及方案所处的阶段（临床前、临床1-3期或商品化）而有显著的差异。一方面，“低需求”适应症可能需要生产规模或培养体积范围为≤10L – 1,000L，即可覆盖从临床前到商品化的需求，目标是每年最多治疗数百名患者。而“高需求”适应症可能需要培养体积10L – 10,000L的商品化规模，目标是满足数千名患者的市场，如诺华对其“Kymriah”的每年治疗数。理想情况下，在工艺开发阶段，生产策略的选择就应已以预期载体需求作为主要考量。

即使不考虑治疗方案和适应症，病毒载体也早已成为一个热点，而行业目前现有的能力很难完全满足市场不断增加的需求。有报道指出，到2026年，仅慢病毒市场销售即可达到$800M，此外，最常使用的病毒载体还包括腺相关病毒、腺病毒以及其它多种溶瘤性病毒。

生产模式

从生物工艺角度看，AAV和LV由于不同的生物学特性，会有不同的挑战。一方面，AAV是一种25nm左右的小颗粒，且包装容量较低。AAV很稳定，无囊膜。在生产过程中，大多数血清型的AAV颗粒积聚在细胞内，通过细胞裂解释放。而LV为80-120nm的大颗粒，从生产细胞膜出芽释放。LV不稳定，主要在于其热不稳定性，且多种因素会损害其载体功能性，如高盐或非中性pH环境，这都对生物工艺的开发造成了不了的挑战。此外，由于病毒形成蛋白的细胞毒性作用，在生产过程中，两种载体都会随工艺时间延长而降低其生产细胞的活性。

目前，AAV和LV的生产仍然是昂贵且费力的工作，需要更加经济、稳健的大规模生产方案。两种病毒载体的主要生产方式是瞬时转染和稳定生产细胞系，在GMP环境中使用的病毒载体上游技术包括贴壁2D平面培养系统、固定床生物反应器和悬浮搅拌罐反应器。每种技术各有其优缺点，细胞工厂的缺点是需要熟练的操作员进行大量的手动操作，且缺乏在线PAT，较难确保可重复性；固定床反应器的缺点是如有报道所指出的，在生物反应器内存在不同的细胞分布和异质性，且反应器规模过大。搅拌罐反应器是良好使用的培养方式，其规模放大性能已经得到证实，且有在线PAT，可实现自动化控制，但挑战在于293细胞较难驯化为悬浮培养，可能使用微载体是一个可行的方案。

病毒载体（LV和AAV）几种典型的不同生产工作流（F.Masri, et al., 2019)。

不管怎样，这些技术在病毒载体生产中仍都将使用，预计未来工艺开发和生产的优化将有助于帮助解决行业所面临的一些问题和挑战，包括：

1. 降低批次失败几率（封闭式工艺）

2. 提高工艺稳健性

3. 产量提升

4. 更快速且可靠的分析方法

5. 通过建立平台化方法，简化工作流

但如果市场对AAV和LV的需求按预期的速率增加，特别是高剂量、高需求的适应症，需在合理的成本条件下获得足够的生产量，则需要开发新的高产量生产方法。连续工艺由于降低的设备尺寸、更高的单位体积产量、流线型的工艺流以及更低的资金成本投入，有可能可显著提高工艺经济性，并获得优化的、一致且更高的产品质量。

病毒载体连续生物工艺当前和未来的挑战

在病毒载体的上游工艺中，连续生物工艺似乎更接近被实际采用，近年来的多篇关于LV工艺开发的报道证明，通过使用灌流模式，在更高的细胞密度条件下生产以及连续收获，有可能可将基础的悬浮批次模式的产量每批次提高1-2个梯度，且这种提高的结果见于稳定生产细胞系和瞬时转染模式。产量的提升可解决行业一部分痛点，首先，尽管培养基消耗量增加，但研究明确显示，生产单位数量的载体所需的成本可直接降低（在R&D阶段，可降低达10倍）。其次，对于相同的载体产出，可显著降低生产规模。例如，1个批次，50L灌流模式生物反应器，产量提高30倍时，可生产与1,500L批次模式生物反应器相当的载体量。这可降低批次失败的经济影响以及设备占地，并简化物流。当然，进行灌流操作需要一些辅助功能设备，但相比采购更大的生产生物反应器，资本性支出投入仍可显著降低。所以，从原则上看，相比批次模式，如果成功转换至GMP生产，即可使用相同的生产平台，而实现产能提升。

而针对病毒载体下游工艺的连续策略可能还需克服多个挑战。病毒载体的下游工艺由一系列复杂的单元操作组成，不仅具有病毒特异性，还具有血清特异性，而且，目前大部分工艺在收率方面效率仍不理想。所以，病毒载体下游工艺在短期内的焦点仍在于批次模式的收率最大化，并尽可能简化工艺。但不管怎样，已有多个研究小组评估了连续下游方法的可能优势，而相比传统批次模式处理，使用多个平行操作的上游平台，以供给一个连续下游处理，是更加经济高效的策略。且从目前的讨论来看，捕获层析可能将是连续工艺第一个被证实的步骤。

从概念上讲，连续生物工艺在降低病毒载体生产成本、提高产能方面有非常大的潜力，包括上游和下游工艺。但是，与任何新技术的采用一样，还有一些问题需要解决，可以使用代谢组学和机械建模工具来理解、预测代谢需求及后续的策略执行，以开发妥帖的培养基工艺方案、灌流速率和/或优化培养基配方，这有助于显著的工艺优化提升，正如基于CHO的单克隆抗体的生产。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：F.Masri, E.Cheeseman, S.Ansorge, Viral vector manufacturing: how to address current and future demands? Cell & Gene Therapy Insights, 2019, 5: 949-970.

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