疫苗开发，我们能帮您做什么？
目前，由新冠状病毒（2019-nCoV）所引起的疫情还在不断蔓延，冠状病毒是有囊膜的单股正链的RNA病毒，粒径为60-140nm。为对抗病毒，全球已经有多个研究团队在加紧研制新型冠状病毒疫苗。据报导，在确保安全有效的前提下，预计最快的疫苗将于4月下旬左右申报临床试验，或者是在特定的条件下，争取进入应急使用。
图片来源：https://www.depts.ttu.edu/ehs/publichealth/News/2019-nCoV.php
新型流行性传染病的爆发，再次引起了人们对疫苗开发的关注。从披露的信息看，在研的疫苗可分为三大类：基于病毒或病毒载体的疫苗、基于DNA/mRNA的疫苗以及基于重组蛋白的疫苗。
本文将简要介绍几种疫苗的特点以及Repligen产品的应用。
病毒和病毒载体疫苗
灭活的完整病毒疫苗
灭活的完整病毒包括经过物理或化学方法灭活的完整病原性病毒颗粒。灭活病毒疫苗的优势包括相对较低的生产成本、良好的安全特性、且不需要复杂费力的基因修饰。但不管怎样，灭活病毒疫苗的生产需要在高级别的环境中培养活病毒，而病毒的灭活步骤可能改变抗原性和免疫源性，这需要在工艺操作中特别注意。
减毒活疫苗
减毒活疫苗是最有效的疫苗之一，其可诱导与自然感染相似的免疫性。该类疫苗含有具有活性但经衰减的病毒。减毒活疫苗的开发通常敲除会产生毒性的病毒基因。总体来讲，减毒活疫苗具有较高的免疫源性，所以不需要佐剂来提高效价，单次免疫通常足以诱导保护性免疫。但是，减毒活疫苗也有一些限制，特别是返毒风险，且绝对需要冷链物流。减毒活疫苗不适合婴儿、免疫缺陷人群以及老年人。
病毒载体疫苗
病毒载体疫苗作为一种新的疫苗形式，近年来获得了极大的关注。病毒载体疫苗可同时表达多个抗原决定子，同时避免使用完整病原性病毒可能导致的安全风险。最常用作抗原递送系统的DNA病毒载体包括痘病毒、疱疹病毒以及腺病毒等，RNA病毒载体包括逆转录病毒和黄病毒等。病毒载体的优势是可在没有佐剂的情况下，诱导抗体和T细胞介导的免疫，且不需要复杂的工艺开发，可生成具有天然构型的抗原，且可递送不止1个基因。
病毒/病毒载体疫苗主要工艺步骤简化流程。
传统上，灌流培养技术较少用于基于细胞培养的病毒生产工艺，主要原因为由于病毒的裂细胞特性，使得培养工艺不会像产单抗的CHO培养一样维持较长时间。但随着行业对上游工艺强化的追求以及灌流技术本身的发展，已有较多病毒-细胞培养工艺开始使用灌流（病毒类生物制品的连续生产），其应用点主要包括1）感染前宿主细胞的灌流培养，以在更高的细胞密度条件下进行感染，2）感染时，通过灌流方式，将生长培养基置换为生产培养基，以及3）在感染后特别是病毒生产晚期，通过灌流补充新鲜培养基，延长病毒生产。如以AGE1.CR.plX培养生产修饰的安卡拉痘苗病毒（MVA）及流感病毒：使用基于ATF的补料分批/灌流混合工艺进行病毒疫苗生产；使用PBG.PK2.1细胞进行流感病毒生产：基于高细胞密度培养的高效流感病毒生产；使用BHK-21悬浮细胞在灌流生物反应器中大量增殖巴西寨卡病毒：BHK-21细胞ATF灌流培养，生产寨卡病毒；以及基于ATF灌流的瞬时基因表达工艺，用于HEK293细胞。
对于培养基的优化，Repligen提供的LONG® R3 IGF-I 细胞培养添加物已被证实可用于多种哺乳动物细胞系，包括CHO、HEK293、VERO以及MDCK，是无血清化学限定培养基或低血清应用培养基开发以及大规模培养系统的理想选择，相比胰岛素，其在细胞培养中的效价可提高200倍，稳定性可提高2倍。
在澄清步骤，Repligen提供两种可选技术：切向流微滤以及切向流深层过滤（TFDF），切向流微滤是一种已被认为并较广使用的过滤技术，其膜孔径一般为0.1-1μm，常用规格如0.2、0.45以及0.65μm，其可截留宿主细胞、细胞碎片等大颗粒，而使病毒颗粒透过，相比离心等传统技术，其优势是设备占地小，可实现全封闭操作，且容易规模放大，更适合工业应用。按过滤器结构分，切向流过滤包括两种形式：中空纤维和平板膜包，一般在澄清应用中，由于裂解液的成分较为复杂，且粘度较高，中空纤维较为常用，特别是待收获病毒对剪切等工艺条件较为敏感时，但对于较为稳定小粒径病毒或部分分泌型病毒，开放流道的平板膜包也可以获得出色的结果。Repligen是少数可同时提供两种类型产品的公司之一，即Spectrum中空纤维以及TangenX平板膜包。
切向流深层过滤（TFDF）是Repligen新近推出的澄清技术，其结合了切向流过滤对膜表面的冲扫作用以及深层过滤的高容污能力，即其既可像切向流过滤一样处理高细胞密度料液，又可像深层过滤一样保证产物透过。初步的内部实验结果显示，透过产物收率可达>90%，在新的澄清工艺开发中，具有非常高的应用潜力。
在病毒颗粒的浓缩、换液等步骤中，基于切向流超滤的UF/DF是行业的金标准，与微滤一样，Repligen提供两种形式的切向流超滤：中空纤维和平板膜包，对于粒径较大（如>100nm）、有囊膜且对剪切敏感的病毒，或需的该步操作中需保证病毒完整性及活性的工艺，流道内液体以温和层流模式运行的中空纤维过滤器可能是更好的选择，而对于粒径较小（如＜50nm）且较稳定的病毒，中空纤维和平板膜包均适用，更多地取决于操作习惯以及已有的设施情况。在病毒UF/DF操作中，最常使用的MWCO规格范围包括100-750kD，孔径的选择取决于病毒的实际粒径，但如工艺流程中包括多步UF/DF，可以在初步UF/DF中选择较大的孔径，以获得更高的通量并去除部分杂质，降低对后续纯化步骤的负担，在最终UF/DF中选择相对较小的孔径，以避免损失，保证收率。Repligen的UF/DF产品在传统的全病毒疫苗或新型的基于病毒载体的疫苗中均有良好，特别是后者，已有越来越多的产品从工艺开发进入临床和商品化，如基于水泡口炎病毒的埃博拉病毒疫苗（rVSV-ZEBOV）。
另外，在病毒相关工艺中，Repligen推荐使用将过滤器与管路、样品容器、快接头以及各监测用传感器完整预组装、伽马辐照灭菌的可抛弃型ProConnex流路，使用此类流路的优势一是免去了实验前流路搭建的时间，加快操作，其次，不再需要进行使用后清洗以及与清洗相关验证工作，而且可实现无菌工艺，对于由于粒径较大而无法最终除菌过滤的病毒，具有明显的优势，但最重要的，也是出于人员防护的生物安全考虑，这种全封闭式流路，可有效避免人员暴露于毒有害物料，如具有传染性的病毒。Repligen提供整合中空纤维或膜包的流路SIUS-Gamma。
除过滤器外，Repligen提供配套的KrosFlo切向流过滤系统，包括工艺开发规模的KR2i系统、中试和小规模生产的KMPi系统以及生产规模的KTF系统，确保工艺的可再现性和线性规模放大。系统均有配用ProConnex流路，而工艺开发规模的KR2i系统由于占地较小，且组装灵活，可整体放入生物安全柜内进行操作，这在病毒类产品的开发中，具有额外的优势。
Repligen的OPUS预装层析柱在传统自装柱之外，提供了另一种选择，OPUS预装柱在尺寸规格和填料选择方面具有无可比拟的灵活性，几乎可装填来自所有填料工艺商的任意填料，包括常用的阴/阳离子交换层析填料、混合模式填料，以及针对特定病毒类型的亲和层析填料。使用预装柱的优势在于不再需要自行购置装柱和拆柱设备，并节省装柱和拆柱相关工作时间，避免操作员暴露于被污染的填料。预装柱可根据需求一次性使用，也可经清洗和储存后，多次重复使用。针对GMP使用，OPUS预装柱可提供除柱效检测报告外的内毒素、生物负荷等相关证书。更多内容，可查看用于工艺开发的预装层析柱、用于下游纯化的预装层析柱以及预装层析柱的适用性：谁最应该使用。
病毒样颗粒
病毒样颗粒（VLP）是在细胞中表达的病毒结构蛋白，具有天然构型的表位。但是VLP是亚单位疫苗，不含基因组，不传播感染。VLP具有重复的抗原性结构，可有效地刺激细胞和体液免疫反应。该领域最成功的案例是HBV和HPV VLP疫苗。
DNA 疫苗
DNA疫苗由编码免疫原的重组质粒组成。该类疫苗通常通过直接注射、基因枪或电转等方式递送进入宿主细胞，然后免疫原表达并启动免疫系统。相比亚单位或基于蛋白质的DNA疫苗有两个明显的优势：DNA容易操作且生产成本较低。
mRNA疫苗
近年来，以体外转录的（IVT）信使RNA（mRNA）开始作为免疫方式得到关注，该类疫苗的优势包括加快免疫原的开发、快速相应、可低成本生产、无感染风险，且具有可控的体内活性，即mRNA可由天然细胞过程降解。但此类疫苗仍需要更多的人体数据，以评估其安全性。根据其复制能力，mRNA可分别非复制型mRNA和自我复制型mRNA。
以E.Coli生产质粒DNA的一般流程。
在以E.Coli生产质粒DNA的工艺中，Repligen的产品可高效应用于以下步骤：E.Coli的收获、澄清、质粒DNA的浓缩，当然，也包括OPUS预装层析柱在质粒精制层析中的应用。E.Coli收获传统上多使用离心，但使用中空纤维过滤方式，收获E.Coli可显著简化操作，且细胞始终处于悬液中，不需要像离心一样重悬细胞，此外，过滤方式也可方便地将体系置换成裂解缓冲液。切向流过滤是质粒DNA常用的浓缩、换液方式，且中空纤维温和的液流模式，可避免破坏DNA的结构，并实现质粒DNA的大规模生产。
此外，为优化核酸疫苗，特别是mRNA疫苗的体内递送，多数会采用脂质纳米颗粒(LNP)或其它类型载体，以优化其体内摄入，如下表所示。
临床研究中的mRNA疫苗（N.A.C.Jackson，et al., 2020）.
而中空纤维切向流过滤在基于纳米颗粒等的新型给药载体的洗滤、浓缩和换液等操作中，具有长久的应用时间和独特的优势，如相比离心，更易操作，更易规模放大，且不会导致颗粒压实或结构破坏，更多信息可参考切向流过滤在纳米医药中的应用案例一、二 & 三以及切向流过滤与离心的比较。
参考文献：
N.Zhu, D.Zhang, W.Wang, et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019, The New England Journal of Medicine, 2020, DOI: 10.1056/NEJMoa2001017.
C.Y.Yong, H.K.Ong, S.K.Yeap, et al., Recent Advances in Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome- Coronavirus. Frontiers in Microbiology, 2019, doi: 10.3389/fmicb.2019.01781.
N.A.C.Jackson, K.E.Kester, D.Casimiro, et al., The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. npj Vaccines, 2020, https://doi.org/10.1038/s41541-020-0159-8.
为支持新冠病毒疫苗开发，我们将为您免费提供用于工艺开发的UFDF相关耗材，包括MicroKros/MidiKros 中空纤维组件以及TangenX PRO PD平板膜包，详情请与我们的客服热线联系，或联系您所在区域的销售负责人。
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