在摇管和生物反应器中进行哺乳动物细胞灌流培养的工艺设计和开发

来自瑞士苏黎世联邦理工学院和Merck Biopharm的科学家们在2019年第116期的《Biotechnology & Bioengineering》杂志上发表了题为“Process  design and development of a mammalian cell perfusion culture in shake-tube and benchtop bioreactors”的文章。文中，作者指出，最高可达到的活细胞密度（VCD_max）、最低细胞特异性灌流速率（CSPR_min）、细胞生长特性以及在稳态操作下的废弃（bleeding）率是灌流培养高效开发的关键变量。故而，研究人员为在规模缩小模型中评估灌流培养的时间和经济效益，使用摇管（ST）结合台式生物反应器（BR），开发了一种针对给定表达系统、在高产率（23pg/cell/day）和低废弃液产物损失（约10%）条件下，用于哺乳动物细胞灌流培养设计的步进式程序。

在第一个实验中，研究人员探索了以1VVD的速率进行不连续的培养基置换，且不进行额外的废弃的条件下，摇管中可达到的峰VCD。然后，基于该数据，在摇管系统中，以10ml的工作体积，进行了稳态培养。对稳态培养的评估，可允许在1VVD的灌流速率条件下，以20x10^6cells/mL的密度运行灌流生物反应器。恒定的细胞环境和代谢可获得稳定的产物质量属性。该研究为给定表达系统灌流培养的有效设计和开发提供了一种有前景的策略，且显示其可能是灌流培养有价值的规模缩小工具。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

设计策略：第一步代表最高可达到的VCD（VCDmax）实验（无细胞废弃），以评估在灌流条件下，所考量细胞系的最大生长潜力。实验设计可确定在给定灌流速率条件下的VCDmax，或表示为临界CSPR（CSPRcrit）。在第二步中，通过向半连续ST实验中引入用于细胞去除的废弃步骤，测试可能VCD设定点的稳定性。这可使操作以接近目标VCD设定点的值进行，从而在台式规模系统中进行稳态灌流实验。在第三步中，在台式规模系统中验证最合适的操作条件，包括产物质量属性的分析（M.K.F.Wolf，et al., 2019）。

详细实验步骤，包括细胞培养、扩增、摇管实验、生物反应器实验、离线检测以及产物质量属性分析，请参考原文。

台式规模生物反应器操作

对于BR生物反应器运行，扩增的细胞接种至1个灌流种子生物反应器1周，之后以接近目标VCD的高细胞密度接种生产生物反应器。

种子培养

扩增1周后，细胞转移至N-1种子生物反应器（Eppendorf，DASGIP，工作体积2L），接种密度0.5x10^6 cells/mL。生物反应器以切向流过滤灌流模式操作，在1周内VCD增加至30x10^6 cells/mL。灌流速率从0.5VVD逐步增加至1.0VVD、1.5VVD、2.0VVD，最终达到2.5VVD，以维持高CSPR，继而高细胞特异性生长速率，以累积足够高的活细胞数量。

生产生物反应器

在下一步中，细胞转移至配用外置XCell ATF 2设备的灌流生物反应器，工作体积2L，ATF使用孔径0.5μm的中空纤维过滤器，流速设置为1.2L/min。进行单稳态实验，短期（14天）灌流培养，目标VCD 20x10^6 cells/mL，恒定灌流速率为1 VVD。使用在线生物电容探针监测并控制VCD，当在线VCD超过目标设定点时，其可直接作用于废弃泵。收获泵以1.0 VVD的恒定流速操作，当达到目标VCD后，转为0.9 VVD。通过重力反馈回路维持反应器重量恒定，其可直接作用于补液泵，从而控制补液/灌流速率。每日添加消泡剂，以防止形成过量的泡沫。

讨论和总结

开发新的灌流工艺时，在选择了细胞系和培养基组成后，下一步就是基于产率和培养基消耗，设计最佳的操作条件。这一般需要在至少数升级规模下进行，因为这是保证能可靠地放大至商品化规模的最低要求。

在本文中，研究人员开发并证实了一种用于新细胞系和治疗蛋白工艺设计步骤的通用程序。在第一步中，实验设计的目标是在灌流样条件下，对所用细胞系的“get-to-konw”。为此，在摇管生物反应器内进行了强化的细胞培养，以筛选在给定培养基组成及1 VVD的置换速率条件下的细胞特异性表征，包括细胞特异性生长速率、代谢物输入和输出率、VCDmax。所以，形成的CSPRmin的第一个值可以认为是CSPRcrit。仔细研究CSPR对细胞生长的影响，可确定摇管中稳态培养基于VCD的操作条件范围，从而用于预测在更大规模培养中的工艺性能。对考量的细胞系，对其消耗的单位葡萄糖所产生乳酸的摩尔比分析显示，在更低的CSPR条件下，代谢向更高效的代谢状态漂移，这与细胞生长减缓、细胞特异性产率提高有关。

基于第一步VCDmax实验的结果，进行了程序的第二步。为此，对摇管操作进行细胞废弃步骤，目前是每日细胞去除，以在稳定的VCD设定点操作。实验后，将最有可能的设定点用于在台式生物反应器系统中进行的验证实验上。在此案例中，稳态摇管实验设计经仔细选择的VCD设定点为15和20x10^6 cells/mL。20x10^6 cells/mL设定点可在1 VVD的灌流速率下维持稳定操作，废弃液中的产物损失为10-15%，获得的CSPR 50 pL/cell/day被认为是CSPRmin。对于台式生物反应器系统，研究人员可以确定给定VCD设定点的合适操作参数。对在ST和BR中获得稳态实验结果进行比较现实，大部分参数保持一致。尽管还有优化的空间，特别是考虑到不同细胞系的差异，但目前的准确性已足够通过合理的实验确定最佳灌流操作条件。

在实验案例中，针对新细胞系开发的灌流工艺呈现出良好的特性。达到稳态后，细胞特异性蛋白质产率保持稳定在23 pg/cell/day，废弃液中的产物损失较低，约为10-12%。恒定的代谢物水平和流速趋势说明所开发工艺的稳定性和稳健性。

从更通用的角度考虑，提出的程序代表了强化哺乳动物细胞灌流培养开发重要的第一步。开发的实验程序是一种稳健的方法，可用于快速开发哺乳动物细胞灌流工艺，以给定的培养基组成，在接近最佳条件的条件下操作。这与CSPRmin的确定程序相对应。

摇管系统较低的培养基用量以及操作的简便性可允许筛选多个条件。VCDmax实验可允许针对不同的培养基组成，测试细胞生长和峰密度，所以代表了一种针对给定表达系统，初步筛选工艺界限的方法（VCDmax或CSPRcrit）。摇管稳态实验允许在恒定细胞密度条件下模拟灌流样工艺，并根据细胞生长速率及所致的废弃率、代谢物消耗和生产速率，预测合适的工艺参数。基于此过程开发的生物反应器规模灌流工艺在达到稳态条件后可保持稳定，进一步的优化操作可测试不同的培养组组成，以降低CSPRmin或在给定培养基组成中加入补液添加物，以调节产物质量属性。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：M.K.F.Wolf, A.Muller, J.Souquet, et al., Process design and developmentof a mammalian cell perfusion culture in shake-tube and benchtop bioreactors.Biotechnology & Bioengineering, 2019, 116:1973-1985.

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