基于细菌外膜囊泡的疫苗平台：生产和纯化

来自荷兰瓦赫宁根大学等的科学家们在2019年的《Vaccine》杂志上发表了题为“Spontaneously released Neisseria meningitidis outer membrane vesicles as vaccine platform: production and purification”的文章。文中，研究人员开发了一种基于细菌外膜囊泡（OMV）、并在其表面表达异源抗原的疫苗生产工艺。作为概念验证，研究人员将Borrelia burgdorferi抗原OspA和OspC表达在脑膜炎双球菌OMV（Nm OMV）上，以创建一种抗莱姆病疫苗。释放在培养上清中的OMV生产由高溶氧浓度诱导，而纯化基于可放大的单元操作。每升培养液可收获90mg OMV蛋白，且异源抗原表达不会改变OMV特性。文章证实，含有异源抗原且良好表征的OMV的生产可以实现，且通过将高氧浓度诱导和优化的纯化工艺相结合，可获得高产量。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

疫苗是最成功的发明之一，通过预防传染性疾病，已经拯救了无数的生命，但目前，传染性疾病仍是全球主要的致死原因。新的传染性疾病的出现需要不断地开发新的疫苗，此外，还有对治疗性疫苗的需求。所以，需要新的疫苗生产技术，以实现更快速的疫苗生产。疫苗平台需可为疫苗开发提供强化的安全性、产量以及简单性。疫苗平台或抗原递呈平台的设计应可通过展示不同的抗原而诱导针对不同传染性疾病的保护作用。细菌外膜囊泡（OMV）是一种合适的疫苗平台候选，其是源于革兰氏阴性菌的纳米颗粒，具有高度的免疫源性，而不具有传染性和复制能力。向OMV加入异源抗原可创造基于OMV的抗原递呈平台，经此基因改造的细菌可在OMV中生产异源抗原。

原文研究的目的是开发一种表达异源抗原的Nm OMV生产平台。首先，研究人员使用基于eOMV（使用无去垢剂方法从细菌细胞中提取OMV）纯化工艺的可用单元操作，设计了用于sOMV（革兰氏阴性菌生产的自发性释放的OMV）的纯化工艺，并对从细菌细胞中分离sOMV的工艺操作进行优化，以获得足够的收率。同时，文章评估了表达异源抗原对细菌培养生长以及OMV表达这些异源抗原的质量的影响。

实验

详细的实验操作，包括菌株、批次培养及分析方法，请参考原文。本文将关注下游纯化工艺及优化。

sOMV生产的整体工艺设计

Nm sOMV生产工艺的设计基于Nm无去垢剂方法提取OMV（eOMV）生产工艺的可放大单元操作。

eOMV和sOMV的生产工艺图示。Nm eOMV和sOMV的生产均从N.meningtidis的批次培养开始。细菌生长后，sOMV可从培养上清液直接纯化，而eOMV的生产需要在特定条件下对浓缩的生物质进行提取处理。两种OMV的下游工艺包括：DNA去除、囊泡浓缩、缓冲液置换、去除残留蛋白以及除菌过滤（M.J.H. Gerritzen, et al., 2019）。

sOMV的下游工艺

收获的培养液冷却至20℃，转移至配有20cm mPES中空纤维组件的KR2i切向流过滤系统。实验首先使用2个3L的批次培养收获液进行跨膜压和流速优化。跨膜压优化时，3L收获液冷却至20℃，转移至TFF系统，中空纤维组件规格为膜表面积85cm2、孔径0.65μm、内径0.7mm。滤液回流至进样容器。TMP通过自动背压阀控制。对于通量优化，使用相同的设置和新的培养收获液以及新的85cm2、0.65μm膜组件，不使用背压阀。滤液流速通过KR2i系统的辅泵KRJr控制。sOMV生产时，使用KMPi系统，配用520cm2、0.65μm的mPES中空纤维组件。冷却的收获液浓缩6倍，剪切率16,000S-1，恒定通量为15LMH。然后，剩余的sOMV使用相同的操作参数，以恒量洗滤模式，漂洗2体积，洗滤液使用pH7.2的3%蔗糖的10 mM Tris-HCl。之后，向sOMV中加入300U/L Benzonase，消解DNA，再使用790cm2、100kD mPES膜浓缩，并以缓冲液洗滤3体积。浓缩后的OMV使用1.2μm-0.5μm死端微滤进一步澄清，再以Sepharose 6 FF层析柱体积排阻纯化。最后，OMV使用0.2μm过滤器除菌过滤。

优化基于切向流微滤的OMV收获

切向流微滤用于从细菌细胞中分离sOMV。测试的工艺基于之前在eOMV生产中使用的生物质浓缩的工艺，对于eOMV生产，切向流微滤用于浓缩生物质，在sOMV生产中，相同的步骤用于去除细菌细胞。冷却的Nm培养液使用孔径0.2μm的中空纤维过滤器以恒定跨膜压模式处理。Nm sOMV的生产可获得无细菌的OMV馏分，总颗粒数为4 x 10^14，为3L培养液生产的5x10^14 OMV的77%。

通过提高溶氧浓度至100%空气饱和度，另一个3L培养液的产量提高4倍至2.0x10^15 sOMV，但该培养液在TFF 微滤中的sOMV的收率显著降低。原因是 OMV的尺寸（100nm）接近0.2μm的孔径规模，OMV尺寸稍微增加或者过滤膜孔的轻度污染都可能影响透过。由于OMV尺寸不会受氧气水平提高的影响，所以推测DNA或者其它细胞碎片可能降低了过滤膜的实际孔径大小。测试0.65μm孔径规格组件，OMV收率稍有提高至29%。

进一步的分析显示，在0.65μm孔径膜实验的开始阶段，OMV的透过很高，但是会快速降低，说明过滤器膜被污染。为了探索提高经高溶氧浓度诱导的sOMV收率的可能性，尝试对TMP进行优化。结果发现提高跨膜压，OMV通过过滤器的量显著降低，特别是在5000S-1剪切率条件下，膜表面的错流似乎都不足以清洗膜。

在恒定滤液流速模式下操作可降低这种高污染培养收获液导致的膜污染。恒定通量方法可确保最低污染的条件，因为通过滤液泵的控制，限制了通过膜孔的液流，从而维持了在膜表面形成清洗作用的液流量。为确定这种模式的操作条件，确定了在三种不同剪切率条件下的临界通量（膜系统在没有污染物积聚的条件下可操作获得最高通量）。5,000S-1剪切率显示最低的临界通量（10LMH），10,000S-1和16,000S-1剪切率具有更高的临界通量（22LMH）。OMV膜透过在达到临界通量前可维持恒定，对于更高的剪切率，透过可维持为70%。且通过对操作步骤进行调整，即先处理5/6的体积，再进行2体积洗滤，OMV收率可达到93%。

讨论

在此研究中，含有B.burgdorferi抗原的Nm sOMV以批次工艺生产，纯化工艺使用可放大的单元操作。异源抗原表达在菌体外表面，且发现其可自发释放OMV。对于OMV的生产，sOMV优于eOMV，因为不需要OMV提取步骤，也就减少了单元操作数量。实验中，研究人员使用高溶氧浓度来触发sOMV释放，可提高产量，但该方法会降低微滤操作中的收率。微滤优化实验显示，在恒定TMP条件下，sOMV透过率在轻度污染情况下会降低，使用更大孔径的膜，并在临界通量50%的恒定滤液通量条件下操作切向流过滤，可将收率提高至90%。

总结来说，研究证实了使用基于OMV的疫苗平台、在脑膜炎双球菌OMV上表达异源抗原以进行生产的可行性。且通过纯化工艺的优化，可成功纯化sOMV，而通过对细菌施加高氧浓度，可获得90mg/L的高纯度OMV。使用该工艺，可生产足够量的含有异源抗原的脑膜炎双球菌OMV，以研究其作为未来疫苗的潜力。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：M.J.H. Gerritzen, M.L.M.Salverda, D.E.Martens, et al., Spontaneously released Neisseria meningitidisouter membrane vesicles as vaccine platform: production and purification. Vaccine, 2019, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.01.076

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