用于蛋白质层析的预装层析柱的柱间装填差异

来自奥地利工业生物技术中心的科学家们在《Journal of Chromatography A》杂志上发表了题为“Column-to-column packing variation of disposable pre-packed columns for protein chromatography”的文章。文中，研究人员指出，在生物制药行业，预装层析柱是工艺开发的标准，但在将其用于实验研究前，须进行质量确认，以确定装填柱床具有所需的性能。层析柱质量确认通常通过脉冲响应实验来完成，其对实验条件的依赖性较高。此外，峰分析方法、柱床的3D装填结构的差异以及工作站的检测精确度会影响质量确认实验的结果。

在此实验中，研究人员量化了各种参数对可抛弃型和非可抛弃型设计的商品化预装柱及自装柱的影响。脉冲响应实验在105根体积0.2-20ml的制备型层析柱上进行，在6种表观流速条件（30、60、100、150、250和500cm/hr）下研究分析物丙酮。不同直径-长度组合的可抛弃型预装柱的柱间装填差异在10-15%，可接受用于目的用途。此外，对于2ml或以下的小规模层析柱来说，必须考虑层析工作站的检测精度。根据可以确定的层析柱之间较低的性能差异，可认为层析柱装填良好，且预装层析柱的柱效与自装层析柱相当或更好。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

在生物生产中，20ml以下的小规模层析柱通常用于工艺开发、规模缩小模型研究、设计空间的探索以及故障排除。对于制备型分离，层析柱可以是购买的“即取即用型”预装柱或由用户自己装填，但预装的制备型层析柱正越来越受欢迎，因为制药厂商可以把费时费力的装柱工作外包出去。层析柱在达到其寿命周期后被废弃，所以可抛弃型层析柱必须简单且方便制造，以便向用户提供“可负担”的产品。自装层析柱通常在使用前需要进行测试，以检查装柱质量，确定缺陷，确保运行的可重复性。而用户使用预装层析柱时只需要进行少量的质量确认工作，因为通常假定此类层析柱具有相同的装填质量。

装填柱床本身在轴向和径向上有较高的非均质性，装填越均匀，峰分散越低，无论是测量的理论塔板高度或偏度。已知装柱方法和层析介质的特性会影响装填柱床的结构，此外，层析柱柱壁的材质和表面特性也会影响柱效，因其会改变装填行为。装填密度是评估柱效需要考虑的一个重要因素，它会影响峰保留和宽度，因其与额外的颗粒孔隙度直接相关。除了装填柱床外，柱效还取决于柱头以及筛板和过滤器的设计。

柱效通常用一种小的无相互作用的溶质的脉冲实验来确定。对于小分子，控制柱效的主要因素是流体动力学分散而不是传质。这就可以用来评估层析柱的装填，而生物大分子则不适用。假定层析柱装填良好，足以针对小分子给出良好的性能值，则其也适用于生物大分子。脉冲响应实验高度依赖于所用的实验设置以及峰分析方法。测试的溶质会影响峰形，所以对于比较性研究，必须保持恒定。注射的样品量会影响峰的统计距，而峰分析还受到噪声和基线漂移的影响。适当的基线校正和积分区间的设置可以确定具有良好精度的较高的距。最常使用的两种峰分析方法是直接积分法和峰拟合至预定的函数。指数修正的高斯（EMG）函数是最流行的峰拟合函数，其可提供稳定的结果，特别是对于有较高实验噪音的峰。

在此研究中，研究人员分析了具有不同长度和直径、装填不同层析介质、体积0.2-20.0ml的预装和自装制备型层析柱的性能，以期为蛋白质层析的规模缩小研究提高参考。通过以不同的流速注射一种非相互作用溶质，对这些层析柱进行了测试。通过数值积分和EMG拟合对峰进行分析，计算一阶和二阶峰距以及峰偏度，并对柱间差异、工作站检测精度以及层析柱尺寸和层析柱类型进行了统计评估。

实验操作和结果分析

详细的实验操作以及结果分析，请参考原文。

层析柱

预装的MiniChrom和ValiChrom层析柱采购自Repligen。MiniChrom层析柱的柱壁为聚丙烯材质，而ValiChrom为玻璃材质。两种层析柱类型的适配器采用不同设计，且具有不同的体积。所有预装柱在柱顶部和底部有相同的筛板和过滤器（聚丙烯/聚乙烯纤维，重量200g/m2，厚度0.42mm）。

Repligen提供的OPUS PD预装层析柱：RoboColumn、MiniChrom、ValiChrom。

层析柱装填4种不同介质：MabSelect SuRe（GE Healthcare，颗粒直径85μm）、Toyopearl Gigacap S-650M（Tosoh，颗粒直径75μm）、Toyopearl SP-650M（Tosoh，颗粒直径65μm）以及Toyopearl Phenyl-650M（Tosoh，颗粒直径65μm）。MabSelect SuRe是一种可压缩的Protein A介质，使用高度交联的琼脂糖作为骨架。Toyopearl Gigacap S-650M和Toyopearl SP-650M介质均为强阳离子交换介质，使用甲基丙烯酸酯骨架。Gigacap填料在骨架和硫丙基功能化之间有一个额外的聚合物连接剂。Toyopearl Phenyl-650 M具有与SP-650M相同的骨架，但由于其使用苯基配基集团进行功能化，所以是一种疏水作用介质。

实验的MiniChrom使用了包括所有可用层析柱尺寸的完整套装，包括以下直径-长度组合（单位mm）：5-10、5-25、5-50、8-20、8-50、8-100、11.3-50和11.3-100。这些层析柱尺寸的每一个都使用MabSelect SuRe或Toyopearl Gigacap S-650M预装三根，每种层析柱尺寸预装Toyopearl SP-650和Toyopearl Phenyl-650 M一根。装填MabSelcect SuRe和Toyopearl SP-650 M的ValiChrom层析柱的直径-长度规格（mm）如下：5-100、5-150、5-200、 8-150、 8-200、 8-250、 11.3-100、 11.3-50和 11.3-200。装填Toyopearl Phenyl-650M的ValiChrom的层析柱的直径-长度规格为：5-100、5-200、8-150、8-200、11.3-150和11.3-200。此外，在实验室使用Tricorn 5层析柱装填了MabSelect SuRe和Toyo Gigacap S-650 M，其设计为非可抛弃型层析柱，直径为5mm。层析柱顶部和底部使用Tricorn5过滤器（乙烯丙二烯/聚乙烯，孔隙度7μm，厚度1.35mm），不使用筛板。层析柱按照优化的装柱层析装填，柱床高度范围为12-162mm。

结论

对独立装填的层析柱上的峰的统计分析显示，相比工作站检测精度导致的标准波动，不同装填方法对波峰的影响显著。AKTA pure 25工作站的检测精度以每根层析柱的三次重复检测确定，对于检测的95%的数量点，一阶矩小于±0.01ml，二阶矩小于±0.007ml。工作站对实验的影响取决于所评估的层析柱体积。尽管检测精度对大体积层析柱的影响可忽略不计，但对于小体积层析柱不可忽略，因为与装填柱床的性能相比，其差异较高。

可抛弃型预装层析柱的柱间差异与层析柱体积有关，所以用相比标准偏差（RSD）来表示。相同直径的层析柱之间的RSD为一阶矩低于1%，二阶矩约为10-15%。评估的层析柱的唯一不同是装填。实验发现，这种差异不能用装填密度来解释，但可能是由于层析柱内颗粒结构的非均匀性导致的。二阶矩的柱间装填差异很小，特别是考虑到对于大于2ml的层析柱的工作站检测精度差异为7.5%，而对于小于2ml的层析柱，可达到25%。第一和二阶矩的差异导致HETP的差异约为15%，如果一个预装柱的用户购买了两根相同尺寸的柱子，这是可预见的丙酮脉冲实验差异。考虑到层析柱通常使用保留溶质，其传质受限，因此性能几乎不会有什么变化。对于评估的层析柱尺寸和介质，预装的可抛弃型层析柱具有与自装层析柱相当或更高的柱效。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：S.Schweiger, S.Hinterberger, A.Jungbauer, Column-to-column packing variation of disposable pre-packed columns for protein chromatography. Journal of Chromatography A, 2017, 1527:70-79.

---

拓展阅读

---

更多阅读

---

OPUS 预装层析柱工作原理

OPUS 预装层析柱简介

OPUS PD预装层析柱的高效应用

---