基于高细胞密度培养的高效流感病毒生产

来自德国ProBioGen AG等的科学家们在2019年1期《Vaccine》杂志上发表了题为“Efficient influenza A virus production in high cell density using thenovel porcine suspension cell line PBG.PK2.1”的文章。文中，作者指出，季节性和流行性流感呼吸道感染仍然是一个主要的公众卫生问题，而疫苗接种是预防流感感染的最有效方法。生产流感疫苗的一个选择是基于细胞培养的病毒增殖，多种不同的宿主细胞系已被证实是流感病毒生产的良好底物，但从容易规模放大角度考虑，悬浮细胞应优于贴壁细胞，理想情况下，其应可复制不同的流感病毒株，同时获得高细胞特异性产量。

在本实验中，作者报道了一种新开发的、用于病毒生产的新型哺乳动物细胞系PBG.PK2.1，经悬浮驯化并优化培养后，其在补料分批模式反应器中，血凝素滴度可达3.24 log10（HA units/100mL）。而对在使用基于中空纤维系统（XCell™ ATF 2）的高细胞密度培养中的病毒增殖进行评估，结果显示出了非常有前景的性能：细胞密度可达50x10^6 cells/mL，活性超过95%，最高HA滴度为3.93 log10（HA units/100mL）。实验获得的平均细胞特异性产率为5,000 virions(病毒子)/cell。所以，新型细胞系结合高细胞密度工艺是下一代流感病毒疫苗生产非常有前途的选择。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介 

疫苗接种是预防和控制流感病毒感染的主要措施。目前，灭活流感疫苗仍使用鸡胚进行生产，但在流行性流感的情况中，使用该技术进行流感疫苗生产的能力会受到生产设施以及鸡胚供应缺乏的影响。作为替代方法，基于细胞培养的病毒疫苗生产已是一种良好建立的平台技术。目前已经有多种使用MDCK或Vero细胞开发并获得上市许可的流感疫苗，报道的最高流感病毒产量是在MDCK悬浮细胞中生产流感A/PR/8/34病毒获得的3.9 log10（HA units/100mL）的滴度。

理想情况下，宿主细胞系应具有20-30小时的倍增时间以及高活性、允许简单的规模放大、可实现快速的高滴度病毒生产，且病毒收获液中的蛋白质和DNA浓度应尽可能低，以方便纯化。此外，安全方面的问题也需要评估。由于流感流行可能来源于不同的动物宿主，所以，有来源于不同物种的细胞底物选择用于生产是有益的。此外，由于流感病毒株和细胞系起源的差异，产率可能会有不同。为了应对流感疫苗日益增长的需求，已开发了多种类型的细胞培养生物工艺，包括体积增加的补料分批培养、连续生物工艺或高细胞密度灌流工艺，且最后一种以及看起来最有应用前景。

文中，研究人员报道了一种源于猪肾细胞且可在化学限定CD-U5培养基中生长的新型悬浮细胞系，PBG.PK2.1，且为了评估已建立的生产工艺的有效性，考查了产物质量、上/下游工艺等方面。PBG.PK2.1细胞可在灌流模式中生长达50x10^6 cells/mL的高细胞浓度，同时获得高活性，最高滴度可达3.93 log10（HA units/100mL），且收获液中的蛋白质和DNA污染物水平较低，可在下游工艺中轻松处理。

材料和方法

实验使用以悬浮驯化的PBG.PK2.1细胞，ProBioGen的化学限定CD-U5基础培养基添加2mM L-谷氨酰胺和重组胰岛素样生长因子（Long R3 IGF，终浓度50ng/mL）。细胞复苏并摇瓶扩增。大规模培养使用DASGIP生物反应器。

对于批次培养模式，细胞特异性生长速率（μ）、细胞特异性底物消耗速率以及副产物生产速率（qs）按以下公式计算：

μ = [ln(x(t_n+1)/x(t_n)]/(t_n+1-t_n)

Yx/s =[X(t_n+1)-x(t_n)]/[C_s(t_n)-C_s(t_n+1)]

Q_s= μ/Y_x/s

其中，X为活细胞浓度；t为培养时间；n为取样时间点；Cs为细胞培养成分浓度。

在生物反应器中的灌流培养

灌流培养使用Eppendorf DASGIP生物反应器，配置带孔径0.2μm、膜面积470cm2 PES中空纤维过滤膜的XCell™ ATF 2细胞截留系统，系统通过气动隔膜泵，将细胞培养液来回泵动通过膜过滤器，置换流速为0.9 L/min。使用微泡（孔径10 μm）进行通气（流速在0.3-0.4 L/h之间调节）。当葡萄糖浓度达到18 mM时，开始灌流。为缩短达到灌流的时间，生物反应器接种细胞浓度为3x10^6 cells/mL。添加的CD-U5作为灌流培养基。细胞特异性灌流速率（CSPR）在批次模式中确定的细胞特异性葡萄糖消耗速率的基础上计算。在恒定CSPR 0.07 nL/cells/day条件下，按以下公式手动调节灌流速率（Q）：

CSPR=q_g/(C_gm-C_gb)

Q=X_i · e^μ.t  · wv · CSPR

其中，q_g为细胞特异性葡萄糖消耗速率；C_gm为培养基中的葡萄糖浓度；C_gb为生物反应器中的目标葡萄糖浓度；X_i为起始细胞浓度；wv 为生物反应器的工作体积。

在以MOI 10^-5进行感染前3小时，使用150-200 mL/h的灌流速率，将0.8-0.9个生物反应器体积置换成新鲜培养基。在感染后1h，生物反应器体积从510mL增加至660mL。在感染时（TOI），灌流培养基额外添加胰蛋白酶22 units/L，pH从7.2增加至7.4。

病毒颗粒浓度（Cvir）、细胞特异性病毒产量（CSVY）和培养基产率（Pv）按以下公式计算：

C_vir= 2 · 10⁷  · 10^(log₁₀^{(HAunits/100μL))}

CSVY = (C_vir,max  · wv_t1)/(X_v,max · wv_t2)

Pv = (C_vir,max · wv_t1)/(V_tot · t_tot)

其中，X_v,max为达到最高病毒滴度时的最大活细胞浓度；wv_t1为最高病毒滴度时的细胞培养工作体积；wv_t2为最高活细胞密度时的细胞培养工作体积；V_tot为在细胞培养和病毒生产阶段总消耗的培养基；t_tot为从细胞培养开始到达到最高病毒滴度时间点的总时间。

工艺强化结果

为进一步强化流感病毒生产，使用XCell™ ATF 2系统，以灌流模式，进行了培养，细胞感染时浓度约为46x10^6 cells/mL。在感染前的对数生长期，细胞活性超过97%，且具有始终如一的生长。事实上，其与批次培养生物反应器中相似的倍增时间说明ATF系统不会影响细胞生长。基于细胞特异性葡萄糖消耗速率结合细胞浓度进行考量，可避免葡萄糖限制。相应的，在感染前的细胞生长阶段，可观察到氨浓度低于1.5mM的。

使用不同细胞培养方式以进行流感病毒生产的结果, 显示灌流模式中可达到的最高细胞浓度、感染时细胞浓度、可达到的最高TCID50 滴度、最高HA滴度均高于补料分批培养，且收获液中的dsDNA和蛋白质杂质水平与补料分批模式相当或更低，而单位细胞病毒产量和单位培养基病毒产量低于补料分批，前者可能是高细胞浓度而导致的未定量病毒生产抑制剂所致，而后者是由于灌流工艺未经仔细优化所致(G.Granicher, et al., 2019)。

由于更高的细胞浓度，可能产生的更高水平的未定量病毒生产抑制剂和其它底物的限制会降低CSVY和滴度。为避免这种限制，通过在感染前3小时提高灌流速率，连续补加新鲜细胞培养基，这使得工作体积在病毒感染后增加了30%。总体来看，在感染后36小时，生物反应器中可达到最高滴度3.93 ±0.05 log10（HA U/μL）。实验中灌流工艺可获得的CSVY为3929±876 virions/cell，低于摇瓶中最佳病毒感染条件下的产量，这种降低可能是由于未定量的抑制剂所致。但相比使用CAP细胞（CSVY=1883 virions/cell）或AGE1.CR细胞（CSVY=1266 virions/cell）的高细胞密度工艺，该工艺的结果仍非常鼓舞人心。考虑到TCID50，灌流培养中获得的 每毫升3.2x10^9 感染性病毒子的结果对于在高细胞密度中进行活性衰减流感疫苗的生产是非常积极的信号。

灌流模式中的单位培养基产率等于1.9±0.3x10^9 virions/L/day，低于补料分批工艺，主要原因在于初步实验未经仔细优化。与以灌流模式进行的重组蛋白生产相似，优化的一种方式是通过降低其灌流速率，提高灌流工艺的经济性竞争力，作为培养基开发策略，步进式降低灌流速率可有效提高使用ATF系统进行的哺乳动物细胞培养的产率。另一种方法是通过更好的控制灌流速率，降低废弃培养基的量。手动调节灌流速率通常不能精确地匹配细胞生长，而导致在细胞生长阶段培养基补液过量。一种控制灌流速率的方法是在考虑细胞特异性培养基需求前提下，使用在线电容探针，确定细胞浓度。而另一种达到更高产率的方法是连续收获，避免病毒降解。

总结

一种用于流感疫苗生产的理想宿主细胞系应在悬浮培养中显示具有稳健的生长，同时获得高活性，便于规模放大，且可实现更快的病毒生产，以达到高滴度，且病毒收获液中的总蛋白和DNA浓度应尽可能低，以便于纯化。

PBG.PK2.1细胞至少适合3种流感病毒株，可获得高流感病毒滴度，且该细胞是高细胞密度工艺的良好候选，因为细胞可灌流模式中生长至高细胞密度，同时维持高活性。最重要的是，CSVY可维持在较高水平，HA滴度可达到3.93±0.05log10（HA U/100μL）。此外，使用灌流模式可得到高TCID50滴度（3.2x10^9 感染性病毒子/mL），这对于活性衰减流感病毒生产非常有益。而从下游工艺考虑，灌流模式收获液中的dsDNA和蛋白质污染物水平较低，可在下游基于层析的纯化中成功处理。

考虑到PBG.PK2.1细胞可达到的高细胞浓度、细胞培养可使用化学限定培养基、可简单规模放大，是非常有前景的疫苗生产候选细胞株，且其可使用灌流进行工艺强化，并可获得更高流感病毒滴度。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：G.Granicher, J.Coronel, A.Pralow, et al., Efficient influenza A virus production in high cell density using the novel porcine suspension cell line PBG.PK2.1. Vaccine, 2019, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.04.030.

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