基于细菌外膜囊泡的H1N1/冠状病毒双联疫苗的制备
来自德国吉森大学等的科学家们在2019年第7期的《Vaccines》杂志上发表了题为“Bacterial Outer Membrane Vesicles (OMVs)-Based Dual Vaccine for Influenza A H1N1 Virus and MERS-CoV”的文章。文中，研究人员开发了一种基于细菌外膜囊泡（OMV）的疫苗，其可递呈甲型流行性流感病毒（H1N1）2009株（H1N1pdm09）H1型血凝素（HA）和中东呼吸道综合征冠状病毒（MERS-CoV）受体结合结构域（RBD）的抗原性稳定嵌合融合蛋白，缩写为OMVs-H1/RBD。研究结果表明，嵌合抗原可诱导对抗两种毒株的特异性中和抗体，免疫的小鼠可形成针对H1N1pdm09的保护，并有效中和MERS-CoV。所以，可认为，递呈病毒性抗原的OMV疫苗是一种对抗两种不同病毒感染的安全、可靠的方法。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
据统计，每年季节性流感会导致全球29-65万人死亡，而近年又出现了一种新的中东呼吸道综合征冠状病毒。H1N1dpm09在猪和人群传播过程中的连续演变以及对人具有高致死率的MERS-CoV感染的出现，在其传播地区造成了重大的公共卫生负担。
免疫是预防和控制由人与人或动物与人之间可传播性病毒性病原体所引起的疾病最有效的医学干预措施，所以开发有效的疫苗非常必要，特别是对于MERS-CoV。MERS-CoV的峰（spike，S）蛋白在病毒侵入中扮演了重要的角色，其通过抗原性RBD结构域结合至宿主细胞受体的DPP4。RBD被认为是一种重要的抗原性糖蛋白片段，诱导有效的体液和细胞中和抗体（mAb）免疫反应。
传统上，流感疫苗生产通过生成表达免疫源性HA抗原的天然或重组甲型流感病毒（IAV）。IAV由两个亚单位组成HA1和HA2，在免疫或天然感染过程中，其是可诱导抗IAV株的特异性中和抗体的抗原位点。本文介绍的疫苗平台依赖于基于质粒的重组病毒抗原的细菌表达，编码病毒抗原的质粒，可被简单、快速地修饰，以在抗原的编码区域插入非同义的变化。
外膜囊泡（OMV）是来自革兰氏阴性细菌的天然、球状纳米颗粒，粒径50-250nm。OMV可从病原性或非病原性细菌释放，且由于组成部分包括了脂多糖（LPS）、细菌外膜（OM）蛋白、脂质、免疫源性毒素、DNA/RNA以及其它浆周蛋白和细胞质蛋白，而具有高度的免疫源性。来自病原性细菌的OMV已经被商业化用于诱导对抗不同菌株的特异性抗体，通过向囊泡内引入外源性抗原，可调节OMV的组成，从而将其作为疫苗平台。这种工程方法具有相当的优势：1）可将抗原截留在其天然结构中；2）可使OMV靶向特定的免疫反应；3）可在单个生产过程中提供多种与之相称的蛋白抗原。所以，本研究设计了一种稳定的、基于OMV的抗H1N1pdm09和MERS-CoV的疫苗，OMV含有由H1N1pmd09的HA1及HA2组成的嵌合血凝素（HA）以及MERS-CoV的受体结合结构域。
pMP-H1/RBD的结构和分泌的OMVs-H1/RBD的鉴定。A）抗MERS-CoV和H1N1pdm09的外膜囊泡（OMV）-免疫平台的示意图。MERS-CoV和H1N1pdm09的目标序列扩增、纯化、消解并连接至pMPccdB载体。含有目标序列的连接质粒转染进细菌，纯化含有重组抗原的分泌OMV，并进行小鼠体内评估。B）OMV的免疫印迹实验结果(M.M.Shehata, et al., 2019)。
实验和分析
详细的实验操作，包括质粒构建、免疫印迹分析、小鼠动物实验等，请参考原文。
OMV纯化和定量
E.Coli DH10β菌转染pMP-H1/RBD质粒，LB琼脂糖平板克隆筛选，接种至5mL 液体LB，培养16h，然后培养液接种至大体积培养。
OMV通常从转染的E.Coli DH10β细胞的上清液纯化。操作时，2L的DH10β培养液于37℃ LB肉汤中摇瓶培养，直到对数生长期（OD600nm 1.0）。生产的细菌离心，上清液使用0.22μm过滤器过滤，去除残留的菌体。之后，无细菌的上清液用KrosFlo KR2i 切向流过滤系统及100kD中空纤维膜超滤浓缩至终体积30mL。获得浓缩液进一步4℃ 150,000xg超速离心3h，分离OMV馏分。之后，含有OMV的沉淀重悬于300μL PBS，除菌过滤，并于-80℃储存。
为对含有嵌合HA/RBD抗原的OMV进行鉴定，使用免疫印迹分析确定OMV中存在MERS-CoV的RBD和H1N1pdm09的H1-HA，并确认存在连接RBD的HA病毒蛋白，其分子量与HA0-RBD之和相当。
详细的实验结果及讨论，请参考原文。
总结
总结来说，实验结果显示，制备的基于OMVs-H1/RBD的疫苗可递呈H1N1的H1型HA和MERS-CoV的抗原性稳定嵌合性融合蛋白，诱导针对H1N1pdm09和MERS-CoV的特异性中和抗体，免疫的小鼠可获得针对两种病毒的保护作用，即证实，递呈病毒性抗原的基于OMV的疫苗是一种非常有潜力的疫苗平台，可同时提供针对两种不同病毒感染的保护作用。该平台也可作为整合不同病毒抗原组合的基础，以制备其它对抗季节性H1N1、H3N2和流感B病毒的疫苗。
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本文为下文简介，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。
原文：M.M.Shehata, A.Mostafa, L.Teubner, et al., Bacterial Outer Membrane Vesicles (OMVs)-Based Dual Vaccine for Influenza A H1N1 Virus and MERS-CoV. Vaccines, 2019, 7(46), doi:10.3390/vaccines7020046.
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