名厨烹制 | 专访艾棣维欣王宾：核酸疫苗技术，不止于新冠疫苗
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来源：研发客
作者：施樱子
目前，多个新冠肺炎核酸疫苗临床试验在全球开展，有望成为疫情“终结者”。B村客官艾棣维欣早在疫情爆发伊始，就与Inovio签订合作协议，联合开发新冠DNA疫苗INO-4800。该产品已获FDA临床研究批准在美国进入Ⅰ期临床试验，并在中国进入IND申请阶段。近日，艾棣维欣创始人以及首席科学顾问王宾博士接受媒体专访，从多个角度与读者分享核酸疫苗的发展历史、技术特点及其在疫情下备受青睐的原因。和小二一起来涨“姿势”吧~
与核酸疫苗的渊源
问
研发客：近期，INOVIO制药的上市公司公告和很多国外媒体的报道中，都称您为中国最著名的DNA核酸疫苗专家（China’s Premier DNA Vaccine Expert）。请介绍一下您与核酸疫苗的渊源？
答
王宾：上世纪90年代，我在美国Wistar研究所David B. Weiner教授实验室做博士后以及我在宾夕法尼亚大学医学院担任助教授期间，从事了大量与核酸疫苗相关的免疫学和药效学研究，以及产品开发工作。1992年，我们开发出了核酸疫苗技术，并利用该技术研制了预防性DNA疫苗及治疗性DNA疫苗产品。
我们在1994年开展了全球第一个核酸疫苗的临床试验，并陆续开展了肿瘤疫苗等一系列项目。这些技术和项目当时转让给了惠氏制药（现辉瑞），从此核酸疫苗也正式成为重要的疫苗研发技术路线，并被誉为“第三代”疫苗技术。David B. Weiner教授因此被誉为“DNA疫苗之父”，并担任国际疫苗协会（ISV）的荣誉主席。
在这期间的十多年的时间里，我亲身经历了核酸疫苗从学术领域的实验室概念，转化为工业界的产品并应用于临床试验的全过程，也学习了如何进行商业化的开发与应用，并与国际核酸疫苗领域有了深厚的渊源。
问
研发客：我们查阅过上世纪90年代核酸疫苗技术发明之初最早期的学术文献，很多您都是第一作者。您当时是如何想到开发核酸疫苗这个全新技术的？
答
王宾：我刚到David B. Weiner实验室时，病毒载体疫苗的概念已经初步形成，我的研究方向是把病毒改造为载体，再把表达外源蛋白的基因包装到病毒载体上制作疫苗。为了比较免疫学效果，我当时把组装好的重组病毒载体疫苗和未经包装的DNA质粒平行免疫动物，实验结果显示两组的免疫效果都很好。我当时甚至不敢相信自己的实验结果，多重复了几次，发现在特定条件下DNA质粒真的不需要病毒载体包装就可以诱导出很好的免疫反应，而且它与病毒载体疫苗相比，最大的优点在于制备过程非常简单。与此同时，美国的另外一名教授也发现了裸露的DNA质粒注入小鼠体内可以检测到蛋白质表达，这个结果印证了我们的发现。之后，我们很快沿着这个思路开发出了核酸疫苗技术。
递送系统是主要门槛
问
研发客：建立核酸疫苗的开发平台，需要具备哪些能力？
答
王宾：首先要清楚选用哪一段序列，能够更有效地表达蛋白质并产生更好的免疫原性，这是疫苗设计中需要考虑的关键因素，其非常依赖于经验的积累，在此基础上就是工艺方面的能力。我认为以下三方面的能力最为重要：
1）序列的设计和优化
2）递送技术和工艺
3）生产制造工艺及质量控制
问
研发客：核酸疫苗最主要的技术开发门槛在哪里？核酸疫苗是如何跨越细胞膜的？
答
王宾：开发核酸疫苗最主要的门槛在于核酸递送系统，即如何让核酸疫苗高效地跨越细胞膜进入细胞内。目前主要分为电转递送和脂质体包裹递送两种主流技术，还有微针递送等技术正在开发阶段。
电转递送技术利用瞬间电流，通过物理的方式让细胞膜打开，使核酸高效地通过。该技术将核酸递送效率提高上千倍，使核酸疫苗的免疫效果在人体中得到了大幅度的提升，而且作为物理的递送方式，安全性也非常好。
目前主流的人用DNA疫苗已经开始使用电转仪。手持式电转仪是一种医疗器械，注射完DNA疫苗之后，用电转仪的枪头在皮肤表面通一个瞬间的局部电流，可以使DNA疫苗快速完成递送。电场一旦消失，细胞膜上的孔洞会自动消失，恢复成完整且不存在损伤的细胞膜。
对RNA疫苗来说，电转也可以大幅提高递送效率，但由于mRNA性质不稳定，降解太快，主流的RNA疫苗都未能使用电转递送，而是采用脂质体包裹递送技术，一方面增加mRNA的稳定性，一方面提高递送的效率。
问
研发客：核酸疫苗通过递送技术进入细胞甚至细胞核之后，是否存在宿主基因组整合的风险？
答
王宾：基因组整合的必要条件是存在特定的整合序列。一些带有特定整合序列的DNA病毒具有整合人类基因组的能力；另一些RNA病毒则可以反转录为DNA，之后在酶的诱导下，通过特定整合序列和宿主基因组发生整合，例如HIV就是RNA反转录病毒。
我在美国Wistar研究所David B. Weiner教授实验室做博士后研究期间，我们的团队就在1994年开展了全球第一个DNA疫苗临床试验期间，。在试验启动前，FDA也曾与我们就此问题进行过深入讨论，最后FDA即制定了DNA疫苗开发的指导原则，包括避免使用和人体基因组整合功能相似的序列、不能使用在人体细胞中有自我复制能力的序列等几条关键的设计原则。
基于这些指导原则，二十多年来全球开展的数百个临床试验没有发现基因组整合现象，也没有发生过一例严重的不良反应，这些都证明了DNA疫苗的安全性。所以从FDA的角度，已经认为DNA疫苗是目前最安全的疫苗技术之一，对于同一DNA疫苗平台的不同产品，无需额外进行GLP毒理学或生物分布研究，也不必开展基因整合毒性研究。
RNA疫苗由于不需要进入细胞核，在不存在整合酶的情况下基本没有基因组整合的风险。RNA疫苗的毒性风险主要来源于人工合成的原料中的核酸类似物所产生的毒性，以及mRNA采用的包裹材料所产生的毒性。
问
研发客：您觉得核酸疫苗与常见的其他类型疫苗如重组蛋白疫苗为主之相比有怎样的独特之处?
答
王宾：这两类疫苗由于抗原在机体内的呈现途径不同，所激活的免疫反应也不同。宿主免疫系统中接触和识别抗原的机制是：APC细胞（抗原提呈细胞）提呈抗原，并迁徙到引流淋巴结，激发后续的适应性免疫应答。
外源的重组蛋白疫苗注射进入机体后，被抗原提呈细胞吞噬加工后，通过MHC-II分子提呈给CD4 T细胞，使其激活并偏向Th2反应，随后B细胞激活并产生水平更高的抗体，表现出来的免疫反应是以抗体为主，而对Th1型的细胞免疫反应，尤其是CD8 T细胞的免疫反应很弱。
核酸疫苗产生的蛋白质抗原则更像是病毒或细菌等病原物在体内生产的蛋白质抗原，被抗原提呈细胞的MHC-I分子和MHC-II分子提呈，分别激活CD4 T和CD8 T细胞，所以核酸疫苗还能诱导产生较强的Th1型细胞免疫反应。
这个性质使核酸疫苗也更适合作为“治疗性疫苗”，可以看到全球有一多半的核酸疫苗都是针对肿瘤开发的，优势在于激活CD8 T细胞的活性，而蛋白质疫苗在这方面比较弱，需要依靠佐剂等手段予以加强。
疫情下为何受青睐
问
研发客：为什么不少新冠疫苗开发选择核酸疫苗作为制备技术？
答
王宾：从产品开发的角度，核酸疫苗的技术平台一旦确定后，生产工艺和质量控制体系都可以通用和复用，不因抗原的基因变化而改变。所以核酸疫苗平台技术CMC方面的标准化程度更高，能够减少临床前的大量工作，适合新产品的快速开发。对于DNA疫苗来说，它的稳定性很好，在室温下可以保存较长时间，适用于疫苗保存条件无法满足的偏远地方或者疫苗的战略储备。
所以在疫情下，不少新冠肺炎疫苗选择核酸疫苗作为疫苗制备技术，这类疫苗的临床前开发时间更短，例如在美国已经进入临床阶段的前两个新冠疫苗都是核酸疫苗。临床研究样品以及上市后产品的生产时间也较传统疫苗耗时更短，同时DNA疫苗的运输也更加方便。
对于DNA疫苗来说，它的产能较高且稳定性很好，在室温下可以保存较长时间，适用于疫苗保存条件无法满足的偏远地方，或者也特别适合新冠疫苗的战略储备。
问
研发客：短期内DNA疫苗和RNA疫苗哪个开发技术难度更大？
答
王宾：DNA疫苗是将人工生产的带有抗原基因序列的DNA质粒注入体内，通过递送技术使质粒跨过细胞膜，在细胞核内转录mRNA，再翻译成蛋白质，诱导人体的免疫系统产生免疫反应。RNA疫苗，是直接将mRNA递送到细胞内，省去了由DNA到mRNA转录的过程，直接翻译蛋白质激活免疫反应。
但成熟的疫苗技术，除了要求免疫学方面的机理清晰，还需要有成熟的生产工艺体系和量产方面的可能性。相对而言，DNA疫苗制备的上下游全套技术更加成熟，DNA质粒通过大肠杆菌发酵，能够快速量产，同时DNA质粒提取纯化出来，性质非常稳定。
而RNA疫苗虽然在体内具有更短的转化流程，但RNA疫苗的相关技术仍需时间来开发和验证。首先，RNA 本身不稳定，很容易发生降解，需要先进的修饰和包裹技术；此外，人工在试管中制备出的mRNA，常常无法在一级序列和二级结构方面和人体DNA自然转录的mRNA保持一致，从而在翻译蛋白质以及激活免疫反应的过程中存在差异。因此RNA的化学合成及大规模生产，都难度较大，研究者需要在mRNA的结构设计方面下功夫，这里有技术突破的很好机会。
问
研发客：艾棣维欣和Inovio为何会携手开发新冠疫苗，双方各具有哪些经验和优势？
答
王宾：艾棣维欣和Inovio两家公司都主要从事核酸创新疫苗的研发。Inovio是第一个将针对冠状病毒MERS-CoV的疫苗（INO-4700）推进到临床研究阶段的公司。同时Ⅰ期研究数据表明，其具有良好的耐受性，并且还在大约95％的受试者中诱导了高水平的抗体反应，同时还诱发了近90％参与者的T细胞应答。给药后60周也维持对INO-4700的持久抗体应答。
艾棣维欣也在DNA疫苗技术与工艺开发、疫苗临床前阶段研发管理、病毒性肺炎临床研究组织和管理方面有丰富的经验，公司在研的预防呼吸道合胞病毒（RSV）感染的疫苗 BARS13，成功完成澳大利亚Ⅰ期 FIH（First-In-Human）临床研究，这是我国企业自主开发的唯一一个处于临床阶段的 RSV 疫苗候选品种，也是全球首个从免疫学机理上解决 VED（Vaccine enhanced disease）问题的创新疫苗。
因此，本次合作能够充分利用双方的经验与优势，加速推进新冠疫苗研发。国际合作也能够分享不同地区的病人临床资源，解决临床有效性的验证问题争取尽快推进新冠疫苗研发。
核酸疫苗的其他应用前景
问
研发客：过往其他核酸疫苗产品的开发进展如何？
答
王宾：在动物疫苗领域，全球已经有五个DNA疫苗产品获批上市了，分别针对马、猪、犬、鸡、鱼的疾病预防，说明DNA疫苗在大动物和小动物中的表现都已经很好，为人用疫苗的开发奠定了良好的动物实验基础。
但人用疫苗的临床开发周期更长。全球有数百个DNA疫苗临床，进展最快的是INOVIO制药的开发的VGX3100，正处于III期全球多中心临床试验阶段，其中也包括中国，这是一款针对宫颈增生癌前病变CIN2/3的治疗性疫苗。
RNA疫苗的进度相对慢一些，这两年有大量的品种启动临床和临床前的工作，最快的已经进入了Ⅱ期临床。在RNA疫苗领域，这两年全球已经诞生了多个独角兽研发企业，包括Moderna、CureVac、BioNTech等，相信随着技术和资金的投入，进度也会越来越快。
按照现在的进展，核酸疫苗已经快到了突破的边缘。预计在不久的将来，一旦有1~2个人用疫苗产品获批上市，完成从新技术到产业化的概念验证，核酸疫苗就会迅速变成炙手可热的技术，制药行业会争相开发核酸疫苗产品。
问
研发客：您在2012年获得国际DNA疫苗大会创新奖，这是基于什么样的工作成果？
答
王宾：这次获奖主要是因为发现了DNA和蛋白质的“共免疫”技术并阐明了其原理，即蛋白质抗原和编码同一蛋白质抗原的DNA质粒在共同免疫动物时，在特定的条件下能够在体内诱导出Treg细胞应答，且诱导出来的Treg细胞是具备该蛋白质抗原特异性的iTreg。
Treg是一类重要的T细胞，主要负责T细胞负反馈“刹车”的功能，在肿瘤免疫和自身免疫病领域都有非常重要的应用。在此之前，Treg领域的免疫疗法只有靶点为Treg的抗体和基于CAR-Treg的细胞过继疗法。共免疫技术首次实现了in vivo诱导iTreg，这个发现为DNA疫苗技术的应用开辟了全新的方向。
我们沿着这个发现，进一步开发出了针对自身免疫疾病的治疗性疫苗技术，并称之为“免疫耐受疫苗”技术。后来，经过持续的探索和研究，我们发现蛋白质加佐剂也能够实现iTreg的诱导，与共免疫达到同样目的。
问
研发客：包括诱导产生Treg的共免疫技术，DNA疫苗未来有哪些最具潜力的应用方向？
答
王宾：我认为最具潜力的开发方向包括以下几个方面：
1）共免疫技术，诱导Treg细胞的免疫调控；
2）针对肿瘤新抗原Neo-antigen的个性化肿瘤DNA疫苗；
3）利用DNA Prime + Protein Boost开发难度较高的预防性疫苗；
4）dMAb技术：利用DNA质粒，诱导人体细胞高效表达生产单克隆抗体。
关于最后这一点，dMAb也叫核酸抗体，是由DNA疫苗发展而来的最前沿研究方向，但已经超过了疫苗的范畴。它的基本原理是，DNA质粒能带很长的基因序列，将它递送到细胞内的，不只是能诱导细胞表达抗原，实际上还能表达抗体。dMAb技术，将人体的细胞变成单克隆抗体的生产工厂，人们以后将不必在体外生产抗体。这会为抗体药物的开发效率、工艺和生产等领域带来全面的革命，有着不可估量的潜力。
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