三代测序的崛起：牛津纳米孔即将上市
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关注近日，牛津纳米孔科技有限公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd.）宣布，准备于今年下半年向伦敦证券交易所提交IPO申请，进行首次公开募股。根据持有牛津纳米股份的IP集团称，牛津纳米孔预计在2021年下半年在伦敦证券交易所上市，但具体时间还要考量市场等多方面因素。
Oxford Nanopore Technologies Ltd是一家私营公司，总部位于英国牛津郊外的牛津科学园，在英国剑桥，纽约，剑桥，旧金山（美国），新加坡，上海，北京设有分支机构，并在全球开展业务其中包括日本，德国，法国和印度。其实它最一开始是一家研究纳米技术的实验室，由Gordon Sanghera博士、Spike Willcocks博士以及牛津大学的Hagan Bayley教授主导创办的，由于其不断的发展壮大，在2005年正式成立为牛津纳米孔科技有限公司。世界首例且唯一的纳米孔DNA/RNA测序仪（MinION）就是牛津纳米孔的研究成果，其具有小巧便携、实时、价格低等优势，可使用场景广阔，覆盖对疾病的监测、食物链监测、环境监测、自我量化，甚至还涉及到微重力生物学等领域，但由于技术还不够成熟，生物信息学的工具也不够完善，还不足以进入市场，只能于2014年进行早期的试验阶段。在之后，牛津纳米孔在此基础上不断地推出新的测序设备与芯片。
测序，通俗来讲就是将DNA的化学信息转变成计算机可读取的数字信息。从1977年研发第一代Sanger技术到如今，已经发展了44年了，每一次技术的变革都促进着疾病医疗研究，基因组学研究，药物研发，育种等领域的巨大发展。
第一代测序技术使用的是吉尔伯特和马克西姆发明的化学法（链降解）或是由1975年考尔森和桑格开创的链终止法。桑格在1977年测出了第一个基因组序列—噬菌体phiX-174,虽然整个长度只有5375个碱基，但是却开启了基因组学的大门。
第二代测序技术以illumina公司的Solexa/Hiseq技术、Roche公司的454技术和ABI公司的SOLID技术标记为核心，在第一代的基础上进行了大量改进。第二代技术大幅度提高了测序的速度，还极大地节约了测序成本，并保持了高准确度，从三年才可以测序完一个人类基因组，缩短到了仅需一周。
第三代测序技术是一个新的里程碑，标志性的特点就是单分子测序，在整个过程中不需要产生PCR扩增，读长超长。牛津纳米孔的MinION便是当中翘楚。具体的原理及优势让我接下来详细为你讲解。
它以先进的测序技术引领着测序时代的浪潮。MinION纳米孔测序仪的核心是一个有2,048个纳米孔，分成512组，由专用集成电路控制的flowcell。在开始测序前，先将双分子DNA与leadadaptor，hairpinadaptor和trailingadaptor连接，当测序开始时，leadadaptor会引领测序分子进入含有酶的纳米孔，leadadaptor后是templateread（即待测序的DNA分子）通过纳米孔，hairpinadaptor则是DNA双链测序的保证，然后complementread（待测序分子的互补链）通过纳米孔，最后是trailingadaptor通过。这种测序方法会形成2Dread，通过对每个接头序列通过纳米孔引起的电流变化的检测，来提高测序的准确性。
MinION的迷你程度大大出乎人的意料，跟一只笔的长度差不多，重量大约在100克，这简直太不可思议了。要知道，无论是Illumina,Pacbio，还是IonProton都有着100斤以上的巨大体积。MinION的打破了一切固有的测序仪的形象，纳米孔技术的出现可以说是开启了测序仪的新时代。
从测序长度来看，其实MinION根本就没有这一说法，因为它已经重新定义了测序读长，理论上，它可以把一条完整的DNA链从头到尾的测一遍，也就是说MinION的测序读长就是DNA的长度。最理想的状态就是测完一整条染色体，但是在实际情况中，样本在制备时DNA是会断开的，这就导致了它的读长也会被断开。
再来看看MinION的测序速度，在测序时，它会有500个纳米孔同时工作，每个孔每秒可测30bp，因此，大概需要3天的时间可以测完1个G的数据。
MinION还可以进行实时数据监控，因为MinION在测序时，需要单分子穿过纳米孔，这种行为引起的电流变化可被检测并识别，这种方式使得用户可在实时监测中根据结果来进行判断，这对于野外和实时诊疗有着巨大意义。
MinION三代测序仪与二代相比最大的优势便是在于reads的读取上有很大差异。MinION测序的序列更长，但单碱基的识别准确程度较差，而二代较短，但识别准确程度较高。对于宏基因组检测来说，reads的读长才是关键。尽管纳米孔测序的准确性略差，但长读长更有利于观察耐药基因与物种的联系，给临床提供更准确的数据。
PromethION beta测序仪发布于2018年5月，前期每个流动槽可支持产生50-100Gb，但现在许多用户都可以轻松产出>100Gb的数据，于是ONT在2019年推出了PromethION 24和PromethION 48。PromethION 24拥有极高的通量，可以运行24个流动槽，可以带来3.8T的数据流量。PromethION 48通量则更高，最多可运行48个流量槽，数据可以高达7.6Tb。PromethION 测序仪更适用于服务供应商和实验室，可用来进行大规模样本研究或动植物的基因组测序，也可以随时进行单个测序实验。
GridION X5是通量介于MinION与PromethION的测序仪，该测序仪拥有5个流动槽，可以以1000b/s的速度对碱基进行检出，流动槽可单独使用，也可协同工作，可在48小时内产出100Gb的数据流量，并可以全面处理数据。GridION X5的出现填补了MinION与PromethION之间的空白。
Flongle其实是MinION和GridION X5测序仪的适配器，是一次性使用设备，它同样采用的是纳米孔测序技术，可以对实时数据进行监测，Flongle拥有126个通道，目前最多可以产生1.8Gb的数据，理论可以产出超过3Gb。所以，它可以驾驭多种类型的测序应用，例如扩增子或靶向panel测序，小型基因组测序，宏基因组测序，同时它还适用于大型纳米孔实验室的质量控制。
对于牛津纳米孔来说，被其他公司起诉侵犯专利总是在所难免。在2017年时，PacBio（太平洋生物科学公司）就在美国特拉华地方法院提出了有关牛津纳米孔的MinIon和PromethIon设备侵犯了其专利US No.9546400的诉讼，而且PacBio还声称，牛津纳米孔在生产和销售时还使得用户也侵犯了该专利。PacBio要求牛津纳米孔停止该侵权行为，并赔偿一切侵权所造成的经济损失。对此，牛津纳米孔的首席执行官Gordon Sanghera则表示这只是竞争对手恶意挑起的无趣诉讼，这并不会影响他们的商业行为以及服务。而最终的裁定结果也显示纳米牛津孔并没有侵犯该专利。
通过阅读牛津纳米孔的2019年的财报我们不难发现，虽然牛津纳米孔年度收入5210万英镑，但是税后仍亏损7220万英镑。在早期IP集团就已经对牛津纳米孔进行了两轮价值3.403亿英镑的种子投资，以换取牛津纳米孔的15.8%的股份。到现在为止牛津纳米孔已经筹资6.13亿英镑，其中都是一些顶级投资机构，例如去年筹到的1.628亿英镑，其中就有阿拉伯联合酋长国的国际控股公司（IHC）和英国养老基金RPMI Railpen的投资基金。还有2018年融资的1亿英镑，领投的机构就有建银国际（控股）有限公司（CCBI）、澳大利亚养老金管理机构HostPlus基金公司、新加坡政府投资公司（GIC）。当一家发展了16年，仍处于亏损状态的科技公司，还能得到世界上许多顶级投资机构的大额资金支持，这说明牛津纳米孔的科技产品和研发团队有着独一无二的优势。而且牛津纳米孔还得到过前英国首相特蕾莎·梅的公开支持，这些投资者们都对牛津纳米孔有着绝对的信任与支持。而如今，牛津纳米孔终于等到了上市的机会，这也是对它的投资者们最好的回应了。
基因测序作为现在医学的尖端领域，它在许多方面的作用都是不可替代的。例如此次的新冠疫情，测序仪就在很多的诊断层面都发挥了巨大的作用，并为后续治疗方案的研发提供了相当大的帮助。我国现在对这一领域的研究与发展也是相当的重视。各大基因公司也投入了大量的人力与资金研发更加先进的测序仪器，比如华大的MGISEQ-T7测序仪，贝瑞和康的NextSeq CN500测序仪都已经进入了全球各大医疗机构。我们已经在路上了，终有一天会站在世界医疗的顶峰！
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