干细胞行业的葵花宝典：生长因子对MSC增殖和存活的调控

       在过去的几年中，生长因子在促进MSCs增殖和存活中的作用已经得到了广泛的研究。大多数生长因子是多营养性的，导致多种生物效应。本文重点探讨了常见生长因子对MSC扩增和存活的影响以及这些效应背后的分子作用机制。

       MSC的一个问题是增殖，通过体外培养扩增过程会丧失MSC的分化、增殖和治疗潜力^{[1, 2]}。因此，为了克服MSC体外培养导致的快速细胞衰老问题，常常在MSC的培养基中添加一些生长因子，一来促进MSC的增殖，二来维持MSC在大规模增殖后的功能特性（免疫调节功能和分泌细胞因子）。下图是各种生长因子对MSC促增值的机制图。

       MSC的第二个问题是存活，MSC输入到体内后，在体内存活的时间比较短暂，导致不能很好地发挥治疗。比如，在输入到缺血心脏之前，用FGF-2，BMP-2和IGF-1对MSC进行预处理培养，显示了存活率的提高^[3]。下图是生长因子对MSC促进存活的信号通路图。

      经典生长因子在与具有内在酪氨酸激酶活性的同源受体结合后，激活几条导致增殖的下游途径：Ras-GTPase通过Raf和MEK到达ERK/MAPK，PI3K激活Akt/PKB，以及STAT途径。Wnt家族关于MSC中Wnt信号的增殖有几个相互矛盾的发现。典型的Wnt信号可以维持干细胞处于未分化但自我更新的状态。通过激活典型的Wnt途径加入Wnt3a可以增加增殖和存活，同时阻止MSC分化为成骨细胞谱系^[4]。Frizzled1和Frizzled4存在于未分化的MSC上，并负责通过Wnt3a进行典型的Wnt转导。此外，Wnt3a还能提高MSC的存活率。Wnt5a，一个非典型的Wnt，竞争与Frizzled受体结合的Wnt3a，并否定Wnt3a对MSC增殖的积极作用^[5]。细胞周期进展因子cyclinD1和c-myc在这两种信号机制中都有涉及^[6]。对另一种非典型Wnt-Wnt4的研究表明，MSC增殖没有变化^[7]。另一组发现意味着Wnt3a启动的典型信号传导抑制人MSC的增殖^[8]。然而，也有研究提出，低水平的典型Wnt信号促进MSC增殖，而高水平的Wnt信号抑制MSC增殖^[9]。围绕Wnt信号的部分争议是Wnt和其他影响MSC的信号通路之间的交叉影响，比如TGF-β1以Smad3依赖的方式引起β-catenin的快速核转位，导致增强MSC的增殖和抑制MSC成骨^[10]。

不同生长因子对MSC的作用汇总表：

表皮生长因子（EGF）

       EGF，分子量为6-kDa，属于比较小的一个生长因子，由血小板，巨噬细胞和成纤维细胞分泌。EGF最初是从小鼠唾液腺提取物中分离出来的，作为一种加速角膜伤口愈合的因子^[11]，但很快就被认识到它确实是一种通用的生长因子，是各种类型细胞的原型有丝分裂原，对各种各样的细胞施加各种作用，包括细胞迁移和增殖^[12]。EGF对MSC的作用机制研究是目前所有生长因子中最详尽的一个。

       EGF受体（EGFR/ErbB-1）是具有内在酪氨酸激酶活性的原型生长因子受体，广泛表达于多种细胞类型，包括上皮细胞和间充质细胞谱系^[13]。EGFR/ErbB-1下游的细胞内信号通路包括磷脂酶Cγ(PLCγ)及其下游钙和蛋白激酶C介导的级联，导致各种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的ras激活，其他小的GTP酶如Rho和Rac，多重信号转导和转录激活子(STAT)亚型，以及异源三聚体G蛋白，磷脂酰肌醇3-OH激酶(PI3K)和磷脂酶D(PLD)。在配体结合和激活后，EGFR/ErbB-1通过膜内吞系统从细胞表面经历内化。

      人MSC表达EGFR/ErbB-1，EGF和HB-EGF（肝素结合的HGF）对MSC的促有丝分裂作用^{[14, 15]}。人MSC不表达HB-EGF的另一种受体ErbB-4；EGF和HB-EGF都只与MSC上的EGFR/ErbB-1结合，下游信号传导级联相似^{[14, 16]}。EGF不激活STAT3以促进MSC的增殖，而是强烈地刺激ERK^[16]。HB-EGF是参与MSC增殖的另一个EGFR配体，表现为ERK1/2的激活和Akt的磷酸化，但Akt的激活明显低于EGF。因此，随着EGFR信号通路的激活，MSC及其早期祖细胞的总体数量将会很高，从而产生足够的细胞用于组织形成。

       EGF通过EGFR/ErbB1提供下游信号通路的持续激活来阻断EGFR/ErbB1内化并增强成骨分化，而可溶性EGF通过诱导受体内化和随后的降解来干扰成骨分化^{[14, 17]}。因此，来自低浓度可溶性EGF的弱信号和暂时性信号起到抑制成骨作用，而来自EGF的强持续信号作用于MSC上的促成骨信号。在EGF表面培养的MSC中已经观察到ERK/MAPK通路的强烈和持续的激活^{[17, 18]}，因此，ERK/MAPK通路可能是EGFR/ErbB-1下游主要的促成骨信号通路之一^{[13, 16]}。

       但是，EGFR/ErbB-1的表达水平在人MSC制备的每个克隆中都是高度不同的，克隆之间的差异高达77倍；而且EGFR/ErbB-1水平与成骨分化能力之间没有明显的相关性，尽管EGFR/ErbB-1在非成骨集落中的平均水平高于成骨集落^[19]。因此，很可能不仅在EGFR/ErbB-1的表达水平上存在异质性，而且在EGFR/ErbB-1的下游信号通路中也存在异质性，即使在相同的MSC制备中也是如此，这也应该导致关于EGF对MSC分化的影响的总体差异^[15]。

        EGF能在不改变分化过程和潜能的情况下刺激MSC的增殖^[16]。EGF和HB-EGF在体外都能诱导MSC的有丝分裂和运动发生反应^{[14, 16, 19]}。

       EGF结合在生物材料的表面，然后MSC附着在这种结合了EGF的生物材料支架上，进行体内植入，结果发现结合在生物材料表面的EGF比饱和浓度的可溶性EGF更强烈地促进细胞扩散和存活，因此，构建结合EGF和MSC的生物材料支架，可以用于治疗硬组织病变，例如大骨缺损^[18]。

      另一种EGFR/ErbB1配体，即TGF-α，进一步增加了MSC的VEGF分泌，以MAPK依赖的方式上调了分泌^{[20, 21]}。EGF处理的MSC进一步促进VEGF和HGF的分泌，但不促进bFGF的分泌^{[15, 22]}。当细胞达到衰老时，它们的EGF受体变得下调，信号衰减高度增加，从而产生对生长因子刺激的抵抗力^{[23, 24]}。

       因此，可溶性EGFR/ErbB1配体（TGF-α，EGF和HB-EGF）不仅在体外增强MSC的旁分泌和自分泌功能，而且在体内，甚至在未愈合的创伤组织内的炎症微环境中也有可能增强其旁分泌和自分泌功能。

转化生长因子超家族（TGF）

       转化生长因子β（TGF-β）是一个好坏参半的因子。在组织器官的纤维化病理变化过程中，TGF-β是促进纤维化发生发展最重要的一个生长因子^[25-28]。但是，TGF-β也能促进软骨细胞增殖、细胞外基质的产生和软骨特异性分子沉积的初始阶段，同时抑制终末分化^{[29, 30]}。当应用于体外骨髓间充质干细胞研究软骨细胞再生时，细胞表现出增殖能力的增加和促进MSC向软骨细胞分化。TGF-β家族有三个成员：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。这三者都能诱导MSC的增殖和软骨细胞的形成，但TGF-β3对软骨形成有最显著的影响，并持续增加MSC的增殖，使其成为从植入的MSC诱导软骨发生的主要因素^[31]。

      骨形态发生蛋白(BMP)-2到BMP-7也属于TGF-β超家族的成员因子。BMP-2，BMP-4，BMP-6，和BMP-7诱导MSC形成成骨细胞，BMP-2对分化的效率最强^[32]。同一家族的另一成员BMP-3使MSC增殖增加三倍^[33]。BMP2与TGF-β3在联合培养MSC，发现MSC的软骨分化明显得到增强^[34]。

      TGF-β或来自家族的其他因子结合一个II型丝氨酸-苏氨酸激酶受体，然后招募另一个跨膜蛋白（受体I）。受体I磷酸化细胞内初级下游分子Smads，导致它们移位到细胞核和特定的基因转录。通过Smad1、Smad5、Smad8是软骨细胞分化所必需的，而通过Smad2或Smad3的信号传导阻断软骨细胞分化^[35]。TGF-β也可以通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，Rho-GTP酶和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途径传递信号^{[36, 37]}。

成纤维细胞生长因子（FGF）

       FGF是一类参与伤口愈合和血管生成的生长因子家族。在这个家族的不同成员中，FGF-2或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）常常用于MSC相关的增殖研究。FGF-2体外培养兔、犬和人MSC增殖增加，当以较低密度接种MSC时，其促有丝分裂作用非常明显^[38-41]。FGF-2不仅保持MSC的增殖潜能，而且通过早期的有丝分裂周期保持成骨、成脂和软骨的分化潜能^[38]。FGF-4，这个生长因子家族的另一个成员，在低密度下也能促进MSC的增殖^[42]。

血管内皮生长因子（VEGF）

       VEGF也是MSC存活研究中广泛使用的因子之一。发生心肌梗死并注射了MSC和VEGF肽的啮齿动物心脏在注射部位显示较高数量的MSC^[43]。存活率的激增归因于Akt信号的增加，导致梗死面积缩小，纤维化减轻，血管增加和心室壁增厚^{[44, 45]}。其他细胞类型的AKT信号转导导致原生存蛋白XIAP，Bcl2和Bcl-xL表达增加，caspase和凋亡蛋白Bad，Bax和Bim水平降低。AKT信号也抑制参与引起细胞周期阻滞和凋亡的转录因子FOX01，FOX02和FOX03^[46]。

      VEGF培养MSC，可以降低了MSC长期培养导致的p16INK，p21和p19ARF的表达，通过增加Akt磷酸化，促进Bcl-xL表达和降低Bax的表达，提高了抗凋亡能力；与单独注射MSCs或VEGF相比，将MSCs与VEGF共同心脏心梗后的缺血缺氧区，VEGF增加了MSC的增殖和存活，并使心功能得到更好的改善^[43]。

       MSC本身不表达VEGF的受体，但是VEGF-A可以通过刺激PDGF受体，促进MSC的迁移和增殖^[47]。低培养代数的MSC表达更高水平的VEGF，能更好地改善大鼠缺血再灌注导致的心脏损伤^[2]。

        TGF-α通过p38MAPK途径增加VEGF的产生并提高回收率^[48]。对于缺血的心脏组织，迄今为止，用VEGF替代MSC是提高生存率的最佳选择，从而改善了缺血心脏组织和分离的胰岛的血管性。VEGF既可以导致MSCs更多的存活，还能对周围的内皮细胞产生旁分泌效应，增加血管生成和形成更多的血管。

血小板衍生生长因子（PDGF）

       目前认为血小板衍生生长因子PDGF是MSCs的非常有效的有丝分裂原（刺激细胞增殖）^[49]。MSC表达PDGF-A和PDGF-C较高水平，而PDGF-B和PDGF-D较低水平，两种受体PDGFRα和PDGFRβ也都表达^[50]。这两种受体均二聚化或异源二聚化产生重叠但截然不同的细胞信号：PDGFRαα与PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-AB结合；PDGFRββ与PDGF-BB和PDGF-DD结合；以及PDGFRαβ与PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-AB结合。PDGF-BB可以诱导MSCs的增殖和迁移^[51]。虽然PDGFRβ抑制成骨，然而，已经观察到PDGFRα诱导成骨^[50]。

       PDGF的早期研究表明ERK信号通路的激活与MSC增殖有关^[16]。虽然ERK在PDGF存在下被磷酸化，但PDGFR抑制剂的加入并不改变ERK的磷酸化水平，这可能意味着ERK激活不是通过直接PDGFR信号传导^[52]。MSC在Akt激活时增殖增加，还促进VEGF的分泌^[52]。此外，在MSC中发现VEGF作为PDGFR的配体^[52]。

肝细胞生长因子(HGF)

       HGF可以激活细胞的Ras-ERK和PI3K-Akt；这些HGF对其他细胞类型激活的主要途径^[53]。抑制增殖可能是通过激活p38MAPK和阻断G0-G1期转变而实现的。这个信号还诱导通用的细胞周期进程抑制剂p21waf1和p27kip蛋白^[54]。因此，HGF似乎不是与MSC一起使用的理想因子。HGF刺激MSC趋化迁移，但不能促进MSC增殖^[55]。因此，HGF/c-met信号系统可能在组织再生的MSC募集位点中起重要作用。HGF长时间培养MSC，会导致MSC的细胞骨架重排、增强MSC的迁移能力，但是抑制MSC的增殖，伴随着干细胞标记物的表达减少，比如Nucleostemin，c-kit和CD105^[54]。

小结

       为了实现MSC的培养扩增，目前多数采用胎牛血清（FBS）。FBS中的污染物可以导致感染，并且某些动物源成分可以触发宿主免疫反应^[56]。无血清培养基主要成分就是一些生长因子，扩增骨髓MSC显示出最令人振奋的结果而且保留了这些细胞的表型、分化和集落形成潜力^[57-59]。但是，无血清培养MSC，常常导致MSC在培养扩增过程中快速衰老。

       MSC本身也分泌各种生长因子和细胞因子，而且这些因子作为旁分泌信号，激活内源性组织细胞的复苏和抑制免疫反应导致的炎症^{[60, 61]}。基于MSC的治疗在很大程度上依赖于分泌各种生长因子和细胞因子的强大能力，以促进血管生成、伤口修复和组织再生^[62-66]。来自老年供体和高代数MSC，被证明具有降低旁分泌活性和减少器官对移植的保护作用^{[2, 67]}。促炎介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或脂多糖（LPS）被证明可以增强骨髓间充质干细胞的旁分泌和自分泌功能^[22]。VEGF和HGF都通过诱导血管生成和改善缺血组织的氧气供应，在MSC介导的加速伤口愈合中发挥关键作用^{[62, 68-70]}。

      生长因子是一种很有希望的MSC佐剂，可以延长MSC存活时间。PDGF、bFGF和TGF-β1的联合应用似乎是一种很好的体外增殖替代血清的培养方法，抑制这些因子中的任何一个都会减缓MSC的生长^[71]。然而，还需要进行更多的研究，以观察这样的组合是否会增强MSC存活，从而有利于伤口微环境中的细胞移植。综上所述，正确选择生长因子及其适当的传递模式将助力MSC治疗，并在不久的将来充分发挥MSC再生组织的潜力。

参考文献：略

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