心梗的干细胞治疗和临床研究最新进展

急性心肌梗塞抢救治疗后，大约23%的幸存者在30天内进展为心功能衰竭^[1]。即使没进展到心功能衰竭阶段，患者生存质量也很低。干细胞的出现及动物实验的有效性，给急性心肌梗塞患者的康复带来很大的希望。虽然药物治疗、溶栓、冠状动脉支架置入和冠状动脉旁路移植术已被临床用于治疗心梗，提高患者的存活率，但这些方法不能从根本上修复受损的心脏，恢复心脏功能。

1，心脏的再生潜能

在成年哺乳动物中，心肌细胞周期进入是极其罕见的，小鼠心室心肌细胞在36小时内进行DNA合成的只有0.0006%；在局部烧灼心肌后测量心肌细胞的DNA合成，观察到略高的增殖指数为0.0083%^[2]。有趣的是，有研究发现心肌细胞的更替率似乎随着年龄的增长而下降，从25岁时的每年1%周转率到75岁时的0.45%；在正常寿命期间，只有不到50%的心肌细胞被交换，这表明人体存在一种低频、稳态再生的内源性机制^[3]。目前尚不清楚心肌细胞是通过干细胞/祖细胞群体的分化来更新，还是通过现有心肌细胞的细胞分裂来更新，还是两者兼而有之。

心肌细胞被认为处于终末分化状态。然而，心肌细胞周期活性和增殖能力在物种和生命阶段不同。来自某些动物的心肌细胞，如Axolotl，青蛙，蝾螈和斑马鱼，保持终生增殖的能力^{[4, 5]}。相比之下，成年哺乳动物的心肌细胞是永久静止的。在受伤后，1天大的小鼠的心脏可以在3周内再生，而且心脏恢复区的大多数心肌细胞来自预先存在的心肌细胞，但是7天龄的小鼠的受伤的心脏不能重新填充丢失的心肌细胞^[6]。这些研究定义了出生后第一周小鼠心脏失去再生能力的过渡期。这个再生时间窗与出生后哺乳动物心肌细胞退出细胞周期的时间段相关^[7]。

一个新生婴儿在心肌梗死后表现出功能性心脏恢复的案例报告，表明人类新生儿心脏具有一定程度的再生能力^[8]。随后有证据表明，心肌细胞更替发生在成年哺乳动物的心脏中，包括人类^[3]。然而，心肌细胞的再生速度太慢，显然不足以恢复受伤的人心脏的收缩功能，在心梗之后可能失去多达10亿个心肌细胞^[9]。因此，建立心脏再生疗法是修复心脏病患者受损心脏的重要步骤。

2，心脏修复的细胞疗法

非心肌细胞，包括骨骼肌成肌细胞，骨髓衍生细胞和间充质干细胞（MSC），已经成为心力衰竭细胞治疗的主要来源。

第一个使用的细胞是骨骼肌成肌细胞，它们被期望使受伤的心脏重新肌化并恢复收缩功能。在动物模型中，移植的骨骼成肌细胞存活并分化为肌源性谱系，治疗改善了缺血性和非缺血性心肌病的射血分数^[10-12]。最初的临床试验显示出积极的效果，移植骨骼肌成肌细胞可以改善缺血性心肌病患者的心功能^{[13, 14]}。不幸的是，长期随访研究没有显示出有益的效果。此外，由于骨骼肌母细胞不能与周围心肌细胞发生电生理方面的整合，发生了诸如心律失常等不良反应^[15]。这些不良的结果排除了骨骼肌成肌细胞在进一步的临床研究中的使用。

随后用于心脏再生治疗的细胞是未经选择的骨髓来源的单个核细胞，这在心脏病的临床研究中得到了广泛的验证^[16]。早期临床试验表明骨髓来源的单个核细胞移植通过改善射血分数对急性心肌梗死患者产生了一些有益的效果。不幸的是，包括更大的患者群体以及良好的随机和双盲设置的多个临床试验并没有重现这些早期的有益结果^[17-19]。

早期临床试验的一个主要缺陷是移植的干细胞分化为心肌细胞的能力有限。因此，科学家们面临的挑战是在体外高效地产生功能性心肌细胞，能够移植到受伤的心脏上。研究的第一个细胞来源是胚胎干细胞（ESC），来源于早期胚胎囊胚阶段的内细胞团。由于ESC很容易扩增，在体外可以分化为心肌细胞，这些细胞为移植提供了获得足够数量的心肌细胞的机会。在心梗动物模型中，将ESC来源的心肌细胞移植到受损的心脏中改善了心功能，尽管植入率很低^{[20, 21]}。但是依然能检测到与ESC衍生的心肌细胞治疗相关的并发症，如心律失常等^{[22, 23]}。此外，使用ESC给临床应用带来了重大问题，如肿瘤发生和免疫排斥的风险。

iPS技术还提供了一种新的基于细胞的心脏修复方法，使自体或异体移植成为可能，并避免了与ESC相关的伦理问题。虽然早期研究表明，移植人iPSC来源的心肌细胞可以减弱免疫抑制的猪心梗模型中的心脏重塑并改善LVEF，但大多数移植的人iPS来源的心肌细胞在受伤的心脏中没有显示出长期存活^[24]。在2016年的一项研究中，移植的异体iPS来源的心肌细胞在猕猴的梗死心脏治疗后存活了12周，心功能得到改善；然而，进行细胞移植的动物有大量的室性心动过速的发生率，这可能是由于移植的iPS来源的心肌细胞的不成熟状态所致^[25]。随着培养技术的发展，在产生高纯度和足够数量的iPS来源的成熟心肌细胞方面已经取得了改进，这些改进有望通过增加移植细胞的数量来提高细胞保留率，并降低与未分化未成熟细胞相关的肿瘤发生和心律失常的风险^{[26, 27]}。此外，为iPS来源的心肌细胞提供支架，如水凝胶或细胞片，可以改善治疗结果^[28]。

3，间充质干细胞治疗

间充质干细胞（MSC）作为一种重要的细胞治疗手段，而且来源非常丰富，被广泛应用于各种缺血性疾病的实验或临床治疗。

多个动物模型均证明MSC能治疗急性心梗，减少心脏梗死区面积、抑制了梗死区的组织纤维化、改善心功能和提高射血分数。甚至韩国批准FCB-Pharmicell公司开发的MSC药物“Hearticellgram-AMI”用于治疗急性心肌梗死。然而，meta分析的结果显示，MSC的治疗效果并不令人满意，MSC移植的急性心梗患者左心室收缩功能(LVSF)的增加仅为3%-10%^[29]。基于MSC治疗心血管的临床前和临床研究显示出不一致的结果，经过综合分析，研究者提出部分关键原因是研究特定剂量和/或给药途径（ROA）的差异^[30]。其他关键的影响因素，还包括细胞治疗过程中的关键步骤，如供体选择、体外扩增、注射途径、在恶性移植微环境中存活、迁移、分化和旁分泌功能需要优化^{[31, 32]}。本文着重从治疗机理和临床研究进行综而述之。

（1），MSC治疗心梗的机理

MSC治疗心梗的机制总结图：

（A）减少炎症反应，避免心肌细胞凋亡和死亡

MSC旁分泌因子包括细胞因子，还有microRNAs和exosome。这些因子可以诱导免疫调节和抗炎作用，通过抑制炎症介质的活性和调节免疫细胞的功能来证明。MSC移植后，受损的心肌组织中单核细胞趋化蛋白-1的水平显著降低，炎症细胞浸润减少和炎症因子浓度降低，同时抑制I型和III型胶原的沉积，从而显著改善了心梗模型的心肌功能^{[33, 34]}。冠状动脉内灌注MSC通过STAT3依赖性机制改善缺血后左心室功能，减少促凋亡和促炎信号传导^[35]。静脉注射脐带MSC，依然可以减少心肌梗死和边缘区的炎性因子（TNF-α和IL-6）和增加促血管生成因子（VEGF和PECAM1），减少胶原纤维的沉积和改善心梗猪的心功能^[36]。静脉注射MSC治疗急性心肌梗死，可减轻大面积心肌梗死小鼠左室功能的进行性恶化和不良重塑，而在缺血性心肌病中，MSC可改善左室功能，其效果明显部分受全身抗炎活动的调节^[37]。

除了细胞因子，microRNAs（miRNA）也参与了MSC治疗心梗的作用机制。miRNA是大约22个核苷酸的RNA，内源性发现并参与基因表达的转录后调节。这些miRNAs中的一些被认为是细胞特异性或组织特异性的，有助于深入了解潜在的病理生理条件。miR-133a是肌肉特异性的，患有MI的患者已被证明具有较低水平的miR-133a，但是miR-133a已知在减轻纤维化和促进心肌重塑中发挥重要作用^[38-40]。因此miR-133a曾被视为心血管疾病的新治疗靶点^[41]。升高的miR-499水平以剂量依赖性的方式影响心脏基因表达，并易发生心脏应激诱导的功能障碍^[42]。miR-499使用的另一种心脏保护机制是钙调尿苷介导的动力蛋白相关蛋白-1(Drp1)激活，可防止心肌细胞凋亡^[43]。但是当在大鼠骨髓间MSC过度表达miR-499时，miR-499会激活wnt/β-catenin信号通路，诱导MSC的心肌分化^[44]。miR-34作为关键的细胞死亡调节因子（负性调节子），其缺失或沉默减少了年龄相关的心肌细胞死亡^[45]。干细胞因子（SCF）是miR-34c的靶点。miR-34c阻断SCF的生成后，骨髓MSC的血管生成能力下降，导致治疗心梗的疗效下降^[46]。研究表明，MSC分泌的外泌体中的miR-132可能通过增强Ras-MAPK信号通路发挥其促血管生成作用，从而发挥改善心梗后心功能^{[47, 48]}。miR-15a/15b靶向VEGF受体2，通过PI3P/PKB信号通路调节MSC存活，从而提高MSC治疗心梗的效果^[49]。通过转基因过表达MIR-10a，还可以使老化的MSC恢复活力，改善了损伤小鼠心脏的血管生成和心功能^[50]。

（B）促进血管再生，改善缺血缺氧

MSC分泌的生长因子（比如HGF、VEGF、bFGF等）具有强烈的促血管生成作用，不仅促进内皮细胞增殖和迁移，而且减少内皮细胞凋亡。MSC不仅分泌VEGF，还分泌血管生成素（Ang）^[51]。血管生成素（Ang）是另一种与管子形成和平滑肌细胞分化和增殖相关的内皮特异性生长因子^[52]。虽然VEGF和Ang都是促血管生成因子，但它们在新血管形成中扮演不同的角色，VEGF是形成新的未成熟血管所必需的，而Ang则更有助于血管的成熟和稳定。VEGF治疗联合MSC移植大鼠MI模型，显著增加了血管密度，减少了瘢痕组织的形成，并改善了心功能^[53]。不同的动物模型都证明MSC通过不同的注射途径，均可以促进血管再生，从而改善缺血区的缺血缺氧微环境，改善心梗后的心功能恢复^{[35, 36, 54, 55]}。不同来源的MSC均显示出良好的治疗心肌梗塞的效果，但是起作用的细胞因子略有不同，比如脂肪MSC主要通过分泌HGF和VEGF^[56]，而羊膜MSC主要通过分泌VEGF和Ang-1^[57]。

脂肪和骨髓MSC已经显示出促进内皮细胞的增殖^[58-60]，然而牙髓MSC却没有显示出这个效果^[61]，但也有实验发现骨髓MSC的培养上清不能促进内皮细胞增殖^{[62, 63]}。这些结果的差异可能在于内皮细胞的分离方法、种属和部位来源^[64]。不同来源的MSC均能诱导内皮细胞的迁移，包括脐带^[65]、羊膜^[57]、脂肪^[66]、牙髓^[61]和骨髓^{[60, 67, 68]}。骨髓MSC及其培养上清均能体外诱导胶质中的内皮细胞形成管状结构^{[58, 67, 69-71]}。MSC不仅能促进内皮细胞形成管状结构，而且能稳定这种新生的血管并促进成熟，这种作用依赖于MSC和内皮细胞的直接相互接触^[60]，MSC发挥着类似周细胞的角色^{[71, 72]}。

（C）预防纤维化

动物实验证明MSC在多个组织器官都有抗纤维化的治疗作用，或预防纤维化，或阻断纤维化进展，包括肝脏^[73]、肺脏^[74]、肾脏^[75]和心脏^[76]。MSC抗纤维化作用存在于多重机制，包括抑制免疫反应导致的炎症^{[77, 78]}、特异的细胞因子^[79-81]、外泌体（包括microRNA）^[82-84]、Wnt/β-catenin信号通路^{[84, 85]}、TNF‑α/TGF‑β1/ERK1/2信号通路^[86]，以及极化巨噬细胞^[81]、抑制成纤维细胞/肌成纤维细胞的激活^{[85, 87]}等等。MSC通过分泌HGF等抗纤维化因子抑制心肌成纤维细胞的增殖，从而减少心肌梗死后心肌纤维化的发生^[88]。不同的脏器纤维化，可能存在一定的特异性，但是动物实验均证明MSC具有一定的治疗作用。从主要组织器官的再生潜能来讲，肝脏的再生能力最强，心脏次之，但是肺脏和肾脏的自我再生修复能力很差。考虑MSC的治疗作用不在于分化为成熟的组织器官的细胞，所以MSC促进组织器官的修复效果，主要取决于这个损伤的组织器官具有自我再生能力。小鼠MI模型显示，MSC治疗可减少MI诱导的心肌细胞凋亡，同时促进血管生成，显著改善了左心室和心肌细胞功能，但不能减轻梗死区心肌纤维化^[89]。

（2），临床治疗效果

基于MSC治疗心梗动物实验的机理研究和疗效，多个研究机构开展了MSC治疗人体心梗的临床研究/试验。

早些年，研究者喜欢用骨髓单个核细胞作为干细胞治疗各种疑难杂症，因为骨髓单个核细胞中含有少量的各种成体干细胞，或许研究者没有纯化培养某种纯一细胞的技术，或许研究者根本就没有想研究清楚这些混合细胞群体里面，哪种（干）细胞起到主要的作用。心血管领域，同样有用骨髓单个核细胞治疗心梗的临床研究报道。

2004年德国报道冠脉内注射自体骨髓单个核细胞治疗急性ST段抬高心梗患者（30例），6个月后，对照组的全球平均左室射血分数增加了0.7%，骨髓细胞（BMC）治疗组增加了6.7%^[90]。同一个团队随后扩大了入组的心梗患者例数（多中心），153名急性ST段抬高心梗患者被随机分组为安慰剂、高剂量BMC、低剂量BMC、辐照的高剂量BMC或辐照的低剂量BMC，在心梗后8.1±2.6天接受一次冠状动脉内注射骨髓单个核细胞，结果发现辐照的BMC没有显著的治疗效果，在6个月时，高剂量BMC治疗组患者的射血分数略优于对照组，但是所有治疗组和对照组没有统计学差异^[91]。德国科学家就这样执着地证明了自体骨髓单个核细胞治疗心梗的无效性。自体骨髓细胞的疗法最大的问题在于只能治疗一次，因为自体骨髓细胞同样不能在心脏的梗死区长期存活下来。

2009年美国随机双盲安慰剂对照的临床试验，异体骨髓MSC外周静脉单次注射治疗急性心肌梗塞，短期内显著提高患者的射血分数，减少室性心动过速，减少左心室收缩末期容积；虽然骨髓间充质干细胞治疗组6个月时候的超声心动图射血分数和安慰剂组没有差异，但是治疗组的左心室射血分数在3个月和6个月时候显著高于安慰剂组^[92]。但是这项临床试验并没有设置阳性对照组（目前的常规治疗组），而且骨髓间充质干细胞的细胞活率只是70%以上^[92]。同一个团队2011年报道经导管心肌内注射自体骨髓单个核细胞或MSC，缩小梗死面积，局部功能在3个月时明显改善，而房室尺寸的变化直到6个月才明显^[93]。

2012年美国Joshua M. Hare教授领导的团队报道了骨髓MSC（MultiStem）的一项I期临床、开放标记和剂量递增对照组研究，心梗后的2-5天，经皮冠状动脉介入注射骨髓MSC（2x10⁷、5x10⁷、10x10⁷）至梗死区域相关血管的外膜，MSC耐受性良好，没有严重的不良反应；4个月后，5x10⁷治疗组和10x10⁷治疗组的患者射血分数和左心室每搏输出量增加比较明显^[94]。2012年和2014年《JAMA》杂志连续报道了美国同一个团队的骨髓MSC治疗心肌缺血的临床研究，经心内膜MSC注射能轻微改善了患者的功能容量、生活质量和心室重塑（梗死面积缩小），但是1年后左心室腔容积和射血分数无变化^{[95, 96]}。JoshuaM. Hare教授持续在干细胞治疗心肌缺血方面执着地努力，并于2017年发表30例缺血性心肌病患者经心内膜腔内单次注射骨髓MSC的临床研究结果；患者接受2000万或1亿个同种异体人骨髓MSC，在30天到12个月期间没有治疗相关的严重不良事件，低高剂量的患者的主要不良心脏事件发生率分别为20.0%和13.3%；虽然这两种细胞剂量都减少了瘢痕大小，但只有1亿剂量稍微增加了射血分数，因此强调了细胞剂量在细胞治疗反应中的关键作用^[97]。

2015年美国的EmersonC. Perin教授开展Mesoblast公司的异体骨髓MSC产品经心内膜注射治疗慢性心衰的临床研究，对安全性和主要不良心脏事件（MACE，即心源性死亡、心肌梗死或血运重建）进行了长达3年的评估；同样证明MSC经心内膜注射是可行和安全的，各组之间的不良事件相似，只有高剂量组（1.5亿MSC）能改善心功能，减少心衰相关的MACE事件的发生^[98]。

2011年丹麦报道心肌注射自体骨髓MSC治疗稳定性冠心病和顽固性心绞痛的可行性、安全性和有效性，经过6个月的随访，心肌灌注没有改变，但是患者增加了运动量，降低了CCS分级、心绞痛发作和硝酸甘油消耗量，并改善了SAQ绞痛问卷评估^[99]。同一个团队在2013年继续报道了3年的最终随访数据，减少了心血管疾病的住院人数，并具有良好的长期安全性^[100]。JensKastrup教授领导的这个团队继续研究MSC治疗心脏缺血研究，这次从骨髓来源切换到脂肪来源，并于2017年发表了健康异体脂肪MSC治疗缺血性心脏病的临床研究结果；在6个月的随访期内，直接向心肌内注射MSC没有引起任何并发症或与治疗或细胞给药相关的严重不良事件；治疗后6个月随访心功能有改善趋势，即左室收缩末期容积减少，左室射血分数增加^[101]。

2013年我国开展自体骨髓MSC冠脉内注射治疗急性心梗的随机对照临床研究，评价冠脉内注射MSC的安全性和有效性，MSC治疗6个月后，两组梗死区心肌活性均较基线有所改善，但MSC与对照组相比无显著差异，SPECT显示骨髓MSC患者的梗死区心肌灌注与对照组无差异；随访12个月和24个月后，LVEF在两组之间没有显示出任何差异；在MSC组中，1例患者在MSC注射过程中发生严重的冠状动脉闭塞并发症^[102]。2015年我国开展的一个多中心双盲对照临床试验，异体脐带MSC单次冠脉内注射治疗急性心肌梗塞，治疗组4个月后的心功能和缺陷区域的血流灌注明显优于对照组，18个月后的左室射血分数高于对照组，也减少左心室收缩末期容积^[103]。

2013年荷兰报道一个随访5年的临床研究，同样证明急性心肌梗死患者心肌内注射自体骨髓MSC是可行和安全的，超声心动图评价左心室功能在MSC治疗后5年内有改善，但是与对照组相比没有显着差异^[104]。2014年韩国一个多中心临床试验以左心室射血分数为主要评价指标，观察到自体骨髓MSC冠脉内注射治疗急性心肌梗塞患者（急性心梗发作后1个月给予自体骨髓间充质干细胞单次治疗），6个月后单光子发射计算机断层扫描（SPECT）显示左心室射血分数轻微改善（和对照组相比较），但是其他指标改善不明显^[105]。2015年印度一项随机双盲单剂量骨髓MSC治疗急性心肌梗死的临床研究，随访时间长达2年，MSC安全性和患者的耐受性都很良好，但是治疗组和对照组的疗效没有明显差异^[106]。

目前MSC治疗心梗/缺血性心脏病的临床研究方案汇总如下：

4，总结

尽管MSC的免疫原性和移植物排斥反应较低，但缺血后微环境中促凋亡因子和局部炎症明显削弱了MSC的存活。目前认为MSC治疗心肌梗塞的机制不在于迁移到损伤心肌部位的MSC分化为心肌细胞，而是通过分泌细胞因子发挥作用^[107-109]。

一项包括34个随机对照试验（RCT）的meta分析显示，接受MSC移植的心梗患者心功能明显改善，左心室射血分数（LVEF）显著增加（+3.32%），共2307例患者；左室舒张末期指数（−4.48）和左室收缩末期指数（−6.73）降低^[110]。另一项涵盖了总共1938名STEMI患者的28个RCT的meta分析显示，MSC治疗导致长期（12个月）LVEF改善3.15%^[111]。最近的一项meta分析也显示MSC治疗的MI患者的LVEF增加了3.84%，并持续了24个月，治疗后6个月瘢痕块减少1.13，室壁运动评分指数减少0.05^[112]。

总得来说，Meta分析的结果显示，MSC的治疗效果并不令人满意，MSC移植的急性心梗患者左心室收缩功能(LVSF)的增加仅为3-10%^[29]。解释新疗法失败的一般原因包括对药物药理学的理解不佳^[113]，分子与疾病之间的联系不佳^[114]，动物和人类的遗传学/表观遗传学中的变异性^[115]。MSC药理学已证明其作用机制的多样性，包括大量生物活性分子的分泌、外泌体和线粒体转移等。

虽然多个meta分析已经证明MSC在一定程度上能改善心功能，包括左心室射血分数的增加，但是没有足够的标准化临床试验，以适当的样本量研究MSC治疗心脏疾病的有效性^[116]。目前一个主要问题是MSC临床试验的多样性，这些试验中只有少数是双中心或多中心，大部分是小型试验。在这些临床试验中，MSC的临床治疗方案也存在明显的差异，包括MSC注射途径（静脉、冠状动脉、心肌内和经心内膜给药)、MSC剂量、给药频次和MSC来源。MSC治疗心血管疾病方面，所有的文章都是单次MSC治疗。但是在MSC治疗肝病和GVHD等疾病时，不少研究者采用了多次MSC治疗。不知什么原因造成不同专业领域对MSC治疗频次的不同理解和应用。

（参考文献：不提供）

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