间充质干细胞为何能静脉注射治疗脑部疾病？

间充质干细胞（MSC）不仅可以穿透血脑屏障，而且还可以作为一种输送工具，直接针对大脑进行治疗，以治疗广泛的脑部疾病。

1，MSC的黏附特性

MSC表达广泛的细胞因子和趋化因子受体，使MSC能够对变化的微环境做出快速反应^[1-5]。但是外周静脉输入MSC后，大部分的MSC滞留在肺部^[6-12]，然后随着血流达到肝脏、肾脏、脾脏^[13]。MSC注射1小时后，50-60%的MSC滞留在肺部^{[8, 9]}，3个小时后降至30%，并维持到96小时^[8]。虽然外周静脉输入的MSC大部分在肺部滞留并被清除，但是MSC可以被肺部局部的微环境所激活，分泌大量的抗炎因子TSG-6，有利于减轻炎症和减少心梗缺血区的面积^[10]。

MSC在肺部的滞留，在很大程度上被认为是因为MSC在培养增殖后体积很大；尺寸范围可能取决于任何数量的培养条件，包括但不限于供体特征的差异，来自不同来源组织的差异，传代数量和培养时的细胞密度^[14]。MSC的肺部滞留也可能是由于与肺内皮细胞的直接相互作用：MSC表达大量的粘附分子，包括血管细胞粘附分子1(VCAM1)和非常晚抗原4（VLA-4），它们可以主动结合肺上皮细胞^[15]。

不同的制备方法可减轻静脉给药MSC的肺滞留。注射MSC重新悬浮在VLA-4的抑制剂肝素中，在体外最大限度地减少了与内皮细胞的粘附^{[16, 17]}。类似地，用抗CD49d抗体预处理以淬灭内源性VLA-4也减少MSC与肺内皮细胞的结合^[6]，而用于获取培养的MSC的酶也可以改变了MSC与肺组织的粘附^[18]。有研究利用MSC的趋化和迁移特性，并增强MSC对靶器官的归巢。研究表明，IL-8、MCP-1和SDF1mRNA的升高吸引MSC到肿瘤部位^[19-21]。

2，MSC鼻腔注射途径是否可行

MSC通过鼻腔注射，作为一种非侵入性的方法，将MSC直接输送到中枢神经系统(CNS)^{[22, 23]}。这些局部给药方法，如鼻腔给药，似乎最大限度地减少了肺部滞留的问题，并使更多注射的MSC归巢到大脑^{[24, 25]}。比如在AD模型和人类患者中，鼻内胰岛素给药能改善了AD型痴呆和非AD型痴呆模型的注意力、记忆力和认知功能^{[26, 27]}。

嗅区位于鼻腔上方，覆盖筛骨筛板下表面，只有10平方厘米，由四种细胞类型组成：基底细胞、支持细胞、三叉神经细胞(眼支)和嗅神经细胞^[28]。嗅神经细胞轴突被一层连续的相互连接的嗅鞘细胞所包围，这个鞘层还被另外几层神经成纤维细胞（ONF）所覆盖，最终形成神经周围鞘^{[29, 30]}。最重要的是，ONF层与覆盖大脑的脑膜是连续的，这意味着在鞘层和ONF层之间形成的神经周围空间与蛛网膜下腔是连续的^[31]。正是这些细胞层和轴突负责将药物通过鼻腔直接输送到大脑。

分子从鼻腔到脑实质的运动是沿着嗅神经或三叉神经进行的。一旦分子被分别传送到大脑和脑桥的神经起点，它们就能够分散在整个大脑中。这一过程通过两条途径发生：细胞内和细胞外^[28]。细胞内的机制始于分子被嗅觉神经元内化，将细胞内的内吞囊泡运输到神经元的投射部位，最后通过胞吐释放。细胞外途径始于药物穿过鼻上皮至固有层，然后通过大量流动过程沿神经元轴突转运至中枢神经系统，药物在那里通过液体运动进一步分布。

然而，神经元移位是一个非常缓慢的过程，这使得它不太可能是分子直接运输到中枢神经系统的主要机制。早期的研究表明，轴突细胞内运输需要长达24小时才能到达大脑^[32]。一项使用WGA-HRP和嗅神经C纤维的体外研究得出结论，在37°C下，外源蛋白的轴突运输有两种速度：一种是以每天130 mm的速度测量，另一种是以每天36 mm的速度传输^[33]。神经细胞轴突传递药物真的是龟速！

鼻腔给药后，胰岛素（5.8 kDa）、IGF-1（7.5 kDa）、GDNF（15 KDa）和白蛋白（65 KDa）均可以被送入中枢神经系统^[34-37]。多种细胞也可以通过鼻腔输送治疗脑部疾病，比如MSC治疗脑瘤放射性治疗后引起的脑损伤^[38]、MSC治疗帕金森病^[39]、MSC治疗新生儿脑损伤^{[40, 41]}、MSC治疗缺血性中风^[24]、神经干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和脑内胶质瘤^{[42, 43]}、调节性T细胞（Treg）治疗EAE^[44]，甚至经鼻给MSC治疗脊髓损伤^[45]。但是多项研究已经给予鼻腔注射胰岛素，胰岛素到达中枢神经系统，而血糖浓度没有任何明显变化^{[26, 36, 46]}。鼻腔白蛋白也被转运到中枢神经系统，但在体循环中几乎没有发现^[35]。另一项研究比较了生长抑素类似物八肽（0.8 kDa）和HRP（34 KDa）的吸收，发现血清生物利用度分别为73%和0.6%，因此，此研究推测1kDa是通过鼻腔给药吸收入全身血液的上限^[47]。

综上所述，经鼻内给药的疗效并不确切。因此，需要非常谨慎的态度对待经鼻内注射MSC治疗脑部疾病的实验数据和结果。

3，MSC穿越血脑屏障(BBB)

血脑屏障(BBB)是一种高度选择性的半渗透边界，它将血液与脑和中枢神经系统(CNS)的细胞外液分开。血脑屏障是由毛细血管壁的内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞在毛细血管中形成的^[48]。

这个系统允许水、一些气体（O2、CO2）和脂溶性分子(激素)通过被动扩散穿过毛细管基底膜，但会限制病原体的通过，限制血液中溶质的扩散，限制大分子或亲水分子进入脑脊液(CSF)^[48]。构成血脑屏障的细胞利用特定的运输通道主动运输对神经功能至关重要的分子如葡萄糖和氨基酸，还有代谢产物^[49]。

颅脑创伤能引起血脑屏障的通透性增强^[50-52]。血脑屏障的通透性增强很可能是大脑创伤后出现癫痫的重要机制^[53]。在损伤、炎症和衰老期间，血脑屏障的紧密连接也会受到损害^[54-56]。这个病理性变化，非常有利于MSC外周血管输入治疗颅脑损伤性疾病，而不需要创伤性地定位脑部微注射^{[57, 58]}。氧化铁标记的骨髓MSC颈动脉注射治疗大脑中动脉栓塞模型（MCAO）大鼠，24小时后，核磁共振成像（MRI）显示MSC能穿过血脑屏障，偏好于沿着血管的走向，迁移到大脑皮层、皮质下白质层、纹状体、脑干部位，甚至观察到MSC能迁移到对侧大脑^{[59, 60]}。但是大脑中却检测不到外周静脉注射的MSC^[60]。甘露醇给药也可以降低了血脑屏障的完整性，因为它导致内皮细胞收缩，随后内皮细胞之间的缝隙连接的大小暂时增加，有利于MSC通过BBB的缝隙连接^{[61, 62]}。

让人惊讶的是，MSC可以在没有帮助的情况下穿越BBB，特别是在MSC可以参与维持BBB的情况下^{[63, 64]}。MSC有很强的穿透血管的能力，比如建立皮肤炎症的小鼠模型，给与静脉注射MSC，观察到约47.8%的MSC在2小时后就穿过血管壁进入肌肉组织（MSC穿透血管的示意图）^[65]。

MSC可能采用类似白细胞与内皮细胞接触的方式（即滚动、粘附和迁移）穿过血脑屏障，尤其是存在炎症因子对内皮细胞有损伤的情况下^{[66, 67]}。

但是MSC在人脐静脉内皮细胞上的滚动速度为明显高于白细胞的滚动速度^[68]。MSC表达多种趋化因子受体和细胞粘附分子（如CD44、整合素𝛼4和𝛽1、CD99等）^[1-5]，但缺乏一些关键的内皮细胞选择素的配体，包括P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）、LFA-1和Mac-1^[68-70]。有研究显示MSC并不表达E-选择素配体，而是通过CD44糖型转化后结合E-选择素来趋化迁移^{[71, 72]}。MSC可以通过VCAM-1/VLA-4与内细胞相互作用，参与MSC在内皮细胞上的粘附和迁移^{[68, 73, 74]}。MSC与内皮细胞通过黏附分子结合后，则通过伪足来爬行、扩散和延伸^[75]。

虽然体外实验发现血液流动速度影响MSC和内皮细胞的相互作用。比如在连续流动条件下，MSC与内皮细胞缺乏相互作用；当血流停止（10分钟）然后启动时，MSC粘附并爬行于内皮细胞表面，延伸出细小的微绒毛突起（丝状足突）^[75]。CXCL9、CXCL16、CCL20和CCL25可显著提高MSC的贴壁率，促进MAEC的跨内皮细胞迁移^[75]。但是，活体动物不存在血流停止10分钟的情况，MSC输入活体动物后，MSC依然能穿过血管，到达血管外的区域^{[59, 60, 63-65]}。

有意思的是，bFGF、VEGF、EPO和IL-6存在的情况下共培养MSC可以显著增加MSC与单层内皮细胞的整合；VEGF、EPO和IL-6促进了MSC的迁移，而bFGF显著降低了MSC的迁移^[74]。MMPs-TIMPs的激活和平衡也与MSC跨内皮细胞迁移有关，这为MSC在体内归巢和外渗到受损组织提供了一个潜在的机制^[76]。MSC的高融合培养还可以增加内源性TIMP-3的产生，减弱MSC的跨内皮迁移能力^[76]。

应该注意的是，无论MSC是从不同的组织来源分离的，不同的培养方式，暴露在不同的细胞因子提示下，还是仅仅包含不同的异质群体，MSC的归巢能力可能已经改变^[77]。因此，不管MSC迁移到大脑的具体机制如何，BBB通透性（无论是炎症还是药物诱导），再加上炎症区域的细胞因子梯度，都会增加MSC向大脑受伤区域的迁移。

4，MSC作为神经营养因子和神经营养因子的来源

无论是急性还是慢性，各种原因（创伤性、炎症性或缺氧性）导致的神经损伤之后，神经组织不能完全自我修复。脑损伤后添加单一生长因子的实验模型显示改善了神经再生和刺激神经细胞存活，为基于MSC的细胞治疗提供重要的实验基础^[78]。体外诱导分化实验证明MSC具有分化为功能性神经元的能力^[79-82]。而且MSC进入体内后，智能地趋化到几乎所有炎症部位，比如骨折^[83]、炎性肠炎^[84]、心肌梗死^[85]和肿瘤^[86-88]，甚至包括脑部胶质瘤^{[89, 90]}。因此，MSC最初被认为是一种适用的治疗脑部疾病的细胞类型。然而，虽然MSC迅速迁移到大脑--在鼻腔注射后2小时^{[24, 25]}--并且确实改善了神经学结果^{[23, 91]}，但这些移植的MSC中的大多数在最初72小时后不再存在^[25]。

外源性MSC很少停留在靶器官中，其修复的机制包括释放可溶性因子、神经营养因子和微泡(MV)^{[78, 92, 93]}。通过这些方式，MSC减少炎症和随后进一步的组织损伤，并促进组织修复和再生。MSC采用多种细胞间通讯方式，包括直接细胞通讯的缝隙连接通讯(GJIC)，间接通讯的释放MV和可溶性因子等。在GJIC中，在两个细胞的细胞质之间形成了一个直接通道，包括miRNA在内的小分子可以通过该通道向靶细胞发送调节信号^[94]。MSC还释放大量含有RNA和蛋白质的MV，包括外泌体，它们也可以作用于靶细胞，以旁分泌和内分泌的方式调节细胞功能^[95-99]。MSC发挥了神经营养和神经再生的作用是通过其分泌物，包括它们的外泌体和其他微囊，而不是通过细胞替换。

5，总结

通过全身给药的MSC在治疗多种神经和脑部疾病方面具有巨大的潜力。这在很大程度上是因为它们能够穿越同种异体屏障和血脑屏障，抗炎特性和聚集炎症区域的能力，以及MSC的分泌体和释放的微囊。然而，影响到MSC疗效的因素实在是太多了，MSC的趋化和迁移只是其中一个方面。

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