eLife | 李毓龙研究组开发检测缝隙连接的新型光遗传学方法
2019年1月14日，学术期刊《eLife》 在线发表北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、PKU-IDG/麦戈文脑科学研究所李毓龙研究组题为“PARIS, an optogenetic method for functionally mapping gap junctions”的研究论文。该研究中，李毓龙研究组开发了新型、可基因编码的缝隙连接探针，并将其应用在细胞系、心肌细胞和果蝇中检测特定细胞间的缝隙连接通讯。
缝隙连接是一种重要的跨细胞通道，可以介导分子量小于约1kD的小分子（如cAMP，IP3，Glucose等第二信使）或离子（H+，Ca2+，K+等）在细胞间的扩散。这种通道广泛地存在于包括脊椎动物和无脊椎动物的各类组织和器官中，介导细胞间的化学和电学信号传递，从而调控发育、维持稳态，保证生物体各个系统的正常工作。中枢神经系统中缝隙连接被称为电突触，是除化学突触之外的另一种重要的神经元传递信息的方式，参与嗅觉、视觉信息处理、认知和睡眠功能等。
图1.PARIS检测缝隙连接的原理
由于现有技术的局限，电突触在大脑中的精确分布和不同脑区中行驶的功能目前仍然缺乏研究。为了更好地研究缝隙连接在复杂系统中的分布及生理和病理条件下的功能，研究人员需要一种非侵入的手段检测组织或活体内特定细胞间的缝隙连接。为了实现这种需求，李毓龙研究组开发出了可基因编码的光遗传学缝隙连接检测工具（PARIS），利用缝隙连接对质子的导通性，以质子作为信号分子，将光控的质子泵（ArchT）和质子敏感的荧光蛋白（pHluorin）分别表达在缝隙连接耦合的细胞中。通过光激活质子泵产生跨细胞的质子梯度，通过pHluorin的荧光变化检测两个细胞间的缝隙连接通讯。
图2.运用PARIS检测果蝇嗅觉系统神经元之间的缝隙连接
由于该工具具有可基因编码的特性，李毓龙研究组通过多种手段将探针表达在不同的样品中，结果表明PARIS可以可靠地在细胞系、心肌细胞以及转基因果蝇的神经系统中重复地检测缝隙连接通讯。在果蝇的不同嗅觉神经元中，PARIS信号表现出高度的时间和空间分辨率，亚细胞水平地揭示了神经元之间通过树突构成的电突触。此外他们还进一步优化了PARIS系统，通过生物信息学筛选找到了比ArchT膜定位更优异、光灵敏约25倍的新质子泵，扩展了PARIS在体应用的前景。该方法首次实现了运用完全遗传编码的方法在特异的细胞类型中非侵入地对缝隙连接通讯进行成像。它结合了光学的高度的时空操纵性和遗传学的特异性，为研究缝隙连接通讯的在体分布、不同生理活动下的功能及调节提供了更多的可能性。
北京大学生命科学学院李毓龙研究员为本文的通讯作者。李毓龙研究组CLS博士毕业生吴玲为第一作者，CLS博士研究生董傲、董利婷为此项研究成果做出了重要贡献。该工作的合作者还包括生命科学学院王世强研究组。本工作获得了北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家重点基础研究发展计划（973计划）、国家自然科学基金和青年千人计划的资助。
李毓龙：
北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心，麦戈文脑研究所研究员
实验室研究领域:
人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。
研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。
具体而言，对于工具开发，我们集中于：
1-结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。
2-开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。
利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：
1-结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。
2-研究神经元中重要的分泌性囊泡“高密度核心囊泡”的蛋白质组学，分析囊泡内的神经肽组成。这些神经肽对于调节食物摄取、侵犯性行为和生物节律有重要的调节作用。
3-寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。
4-结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。