Neuron | 李毓龙研究组报道新型基因编码的去甲肾上腺素荧光探针

2019年3月25日，学术期刊《Neuron》在线发表北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、PKU-IDG/麦戈文脑科学研究所、北京脑科学研究所李毓龙研究组题为“A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine”的研究论文。该研究中，李毓龙研究组首次成功开发了新型、可基因编码的去甲肾上腺素荧光探针，并将其成功应用于斑马鱼和小鼠中检测内源去甲肾上腺素的动态变化。该探针可特异性地区分结构相似的去甲肾上腺素与多巴胺，将成为研究去甲肾上腺素相关神经环路的重要工具。

去甲肾上腺素（Norepinephrine, NE）作为一种重要的单胺类神经递质，在中枢神经系统和交感神经系统中都参与诸多必要的生理过程，如感觉信号的调节、注意力的调控、清醒与睡眠、学习与记忆等。去甲肾上腺素释放或信号传递的受损与一系列的精神疾病和神经退行性病变息息相关。因此，在复杂神经环路中以高时空分辨率的方式检测去甲肾上腺素的动态分布对完整解析去甲肾上腺素在生理及病理条件下的功能和调节尤为重要。然而受限于现有技术的灵敏度、特异性、时空分辨率和组织创伤性等，无法实现对它在体分布的精确检测。

为了解决以上的技术瓶颈，李毓龙研究组开发并优化了一类基于G蛋白偶联受体激活（GPCRActivation Based）的去甲肾上腺素荧光探针（GRAB_NE）。通过在人源去甲肾上腺素受体特定位置嵌入对结构变化敏感的荧光蛋白（cpEGFP），使去甲肾上腺素这一化学信号转化为荧光信号，结合现有的成像技术，即可实时监测去甲肾上腺素浓度的动态变化情况。通过对探针全方位的优化，开发出具有低/高亲和力的两种版本的荧光探针（分别命名为NE1m和NE1h），除均具有极高的分子特异性和时空分辨率外，还可分别用于检测局部突触传递（synaptic transmission）和非局部非突触传递（volume transmission）的去甲肾上腺素释放。

基于G蛋白偶联受体的去甲肾上腺素探针

利用该可遗传编码探针，李毓龙研究组通过转染、病毒注射以及构建转基因动物等手段，可将探针表达在细胞、小鼠脑片、斑马鱼和小鼠中。通过构建转基因斑马鱼系在斑马鱼大脑神经系统中广泛表达GRABNE1m探针可成功检测清醒斑马鱼中脑由视觉刺激引发的与时间锁定的特异性NE释放，通过稀疏标记去甲肾上腺素探针还可记录到单细胞分辨率下重复视觉刺激引发的NE释放信号。通过病毒介导的表达，使用激光脉冲对LC-NE神经元的光遗传学激活可靠地引起自由移动小鼠LC的光纤记录信号中GRABNE1m荧光的增加。在小鼠强迫游泳测试和尾部悬吊测试（两者均为经典的应激性行为）期间，观察到由应激行为触发的GRABNE1m荧光显著增加，揭示该行为与NE动态变化的关系。

北京大学生命科学学院李毓龙研究员为本文的通讯作者。李毓龙研究组博士生冯杰思为第一作者；井淼、王欢、张雅君、董傲、武照伐、吴昊为此项研究成果做出了重要贡献。该工作的合作者有：中国科学院神经科学研究所的杜久林研究组；纽约大学的林大宇研究组；美国国立卫生研究院的崔国红研究组；弗吉尼亚大学医学院朱骏研究组；南加州大学的Andrew S. Hires研究组。本工作获得了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家重点基础研究发展计划（973计划）、国家自然科学基金、美国脑计划对李毓龙研究组的大力支持。

李毓龙课题组一直以来致力于系统性地发展前沿神经生物学探针技术用于研究复杂神经细胞之间的多种通讯连接，2018年已经率先在世界上发展了乙酰胆碱（Jing et al., Nature Biotechnology, 2018）及多巴胺探针（Sun et al., Cell, 2018），2019年又报道了用于定位电突触的荧光探针（Wu et al., eLife, 2019），这次报道的去甲肾上腺素探针，是这一系统性工作的又一重要环节，为今后开发其他神经递质、神经调质探针奠定了扎实的研究基础。

研究组介绍

李毓龙：

北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心，麦戈文脑研究所研究员

实验室研究领域:

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：

1-结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。

2-开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。

利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：

1-结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。

2-研究神经元中重要的分泌性囊泡“高密度核心囊泡”的蛋白质组学，分析囊泡内的神经肽组成。这些神经肽对于调节食物摄取、侵犯性行为和生物节律有重要的调节作用。

3-寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。

4-结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。