单抗糖基化调控之控制参数篇(上)

关键质量参数是单抗仿制药研发的标杆，包括糖基化修饰、聚体、电荷异质性等，其中如糖基化修饰对单抗的生物活性、免疫原性、药物代谢动力学、构象、稳定性及溶解度具有重要的影响。细胞培养过程中细胞所处环境，如pH、温度、渗透压、溶氧等参数会影响到单抗糖基化表现，本文就文献中对渗透压、培养时间和溶氧等培养控制参数，以及温度、剪切力和培养模式对糖基化影响的研究进行了简要总结。

渗透压和培养时间

体系中渗透压的调节可以通过向基础培养基或补料培养基中加入NaCl实现，从而考察渗透压对细胞生长、蛋白产量及质量的影响。Efren Pacis团队将基础培养基渗透压分别配制为300、330、360和400 mOsm/kg，补料培养基的渗透压为750和1250 mOsm/kg，并取不同时间段的样品进行检测，进而就渗透压及培养时间对蛋白糖基化的影响进行研究，实验过程中采用的为CHO细胞。

以渗透压为300 mOsm/kg的基础培养基和750 mOsm/kg的补料培养基为对照组，如图1所示，D22天时对照组的Man5为15%，而当基础培养基的渗透压为400 mOsm/kg时其Man5为18%；相似条件下，而将补料的渗透压增加到1250 mOsm/kg时，Man5的比例增加到23-27%。而G0F的表现则刚好相反，渗透压升高时会导致更低的G0F比例，不同渗透压条件下G1F的差异性并不大。Efren Pacis的实验中，随着渗透压的增加，Man5增加，G0F降低，G1F波动较小，研究人员在CHO-B、C、D和E中均发现了类似的情况。

图1 不同基础培养基(300、330、360和400 mOsm/kg)和补料培养基(750和1250 mOsm/kg)时的糖基化表现(a. Man5; b. G0F; G1F) (来源于参考文献1)

此外，从图1中还可以看出，随着培养时间的增加，Man5呈上升趋势，而G0F和G1F均表现为下降趋势，这可能与蛋白的一些自发过程有关。而且，高渗透压情况下细胞的生长还会受到抑制，蛋白的产量也会降低。由于人类自身细胞表达的蛋白抗体的高甘露糖糖型(Man5-9)一般在5%左右，正常情况下不采取高渗透压的培养条件。

为解释渗透压影响糖基化的机理，研究人员对GnT-1 (N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I，调控Man5与其他糖类链接)的mRNA水平进行了检测。分别取不同渗透压实验组D3、7、12和14的样品进行测定，检测结果显示不同渗透压组GnT-1的mRNA差异性很小，渗透压对Man5水平的影响可能是通过影响GnT-1酶活或是影响mRNA的转录。

溶氧(Dissolved Oxygen，DO)

作为细胞培养的一个重要参数，一般实验规模或生产规模中常常设置为40%，但也会存在个例。有学者认为将DO范围设置在25-50%时是最优的细胞培养条件，即使细胞可能会缺氧；而将溶氧维持在过高水平时会加速过氧化物的形成，对DNA、蛋白和脂质等产生损伤，也会导致细胞生长变差。

有时会因为传质效果差或细胞对氧需要高而将溶氧设置很高，如60-80%，且不考虑这样的参数设置是否可以真正的解决问题，先了解下溶氧对单抗糖基化的影响。学者对于DO对蛋白糖基化影响的研究结果也是不一致的，如有学者研究表明低水平DO会降低半乳糖糖基化，而其他研究则指出DO不会影响半乳糖化，可见DO对糖基化的影响还与细胞系等因素有关。

VeronicaRestelli等在2.4/4L的培养体系中研究了3、10、50(对照组)、100和200%的DO对细胞生长、蛋白产量及糖基化的影响，采用CHO-K1细胞系合成促红细胞生成素(EPO)。

VeronicaRestelli首先用弱阴离子交换柱将EPO进行分离，然后再对得到的蛋白进行唾液酸化程度的分析研究。其检测结果如表1所示，在所得样品中唾液酸化水平基本都在83-93%，平均水平为89%。除100% DO的16.37%的非唾液酸化外，其他水平的DO的非唾液酸化基本一致。对EPO不同结构类型(复合型、杂合型和高甘露糖型)的糖基化研究，Veronica Restelli采用了HPLC的检测方法，结果表明DO的不同设定值对其没有影响。

表1 DO对EPO唾液酸化的影响

(来源参考文献2)

不同的DO设定(3、10、50、100和200%)下蛋白的岩藻糖化范围为75-81%，如图2所示，当DO为50%或100%时岩藻糖水平最高为80%左右；而当DO为3、10和200%时，蛋白的岩藻糖水平均在75-76%范围内。即当DO为50%或100%时，岩藻糖化水平最高，随着DO的增加或降低而逐渐降低。总体来讲，Veronica Restelli的实验研究中EPO的糖基化修饰在较宽的DO范围内变化较小，类似的环境下实验中使用的细胞株对DO的耐受性高。

图2 DO对EPO岩藻糖化的影响

(来源参考文献2)

Kunkel等研究了DO对IgG半乳糖化的影响，其对三个梯度的DO (10、50、100%)进行了实验，结果表明提高DO浓度可以促进IgG的半乳糖化，如图3所示。当DO为10%的G2的含量为12%，而当DO为100%时G2的含量提高到30%，G1的变化随DO的改变并不明显。

DO对蛋白糖基化影响的作用机制还不明确，有学者认为DO降低会细胞对UDP-Gal(Uridine diphosphate galactose，尿苷二磷酸半乳糖)的利用率，从而进而进入到高尔基体的前体物降低；还有的认为前期含二硫键的重链化合物会极大的影响半乳糖化过程。

图3 DO对IgG半乳糖化的影响

(来源参考文献3)

温度(Temperature)

生物反应器温度是控制细胞生长及蛋白产量的重要手段，细胞培养过程中最佳培养温度(Temperature, T)一般为37℃左右。培养前期37℃的培养温度以获得较高的细胞密度，而当细胞密度接近Peak时，降低温度至30℃左右是延长对数期的常用手段，以此可以得到较高的蛋白产量。

但是Temp Shift不仅仅可以提高蛋白产量，有研究发现低温条件下细胞内的蛋白酶及其他毒性酶的活性会降低，从而在一定程度上提高蛋白的质量，下面就Temp Shift对糖基化影响的相关研究进行简要概述。

Michael等对不同的Temp Shift时间(早期、中期和晚期)对唾液酸含量的影响进行了研究，如图1所示，降温时间越晚细胞的Peak VCD越高，但是降温时间对唾液酸含量的影响几乎可以忽略。当培养温度在早期(D3)、中期(D4)和晚期(D5)进行调节时，研究取D11天样测得的唾液酸含量分别为0.98、0.98和0.92，此外在三种不同方案下的D10和D12天的唾液酸含量基本一致。

即在Michael的研究体系中，D3、D4和D5调节培养温度对唾液酸没有明显的影响，但会影响到细胞的表现，另外研究人员并没有未进行Temp Shift的实验对照数据，因此Temp Shift对体系中蛋白糖基化影响的研究并不彻底。虽然Temp Shift对唾液酸总量的影响不明显，但其对唾液酸的两种形式Neu5Gc和Neu5Ac的比重有明显影响。当推迟Temp Shift时间时，Neu5Gc水平明显降低了29-59%，即影响两者的相互转换，但对总体的唾液酸量没有影响。

图1 不同的Temp Shift时间对细胞生长(左)及蛋白唾液酸化(右)的影响

(图片来源于参考文献4)

在Mariela的另一篇文章中其还研究了CHO-K1-hGM-CSF细胞系对于不同培养温度，37℃和33℃，对细胞生长、hGM-CSF产量及其糖基化的影响。在实验组中，研究人员将一组实验始终维持在37℃进行培养，而另一组是当细胞密度接近Peak时降低温度到33℃。

研究发现，低温(33℃)对细胞的活率维持有利，并且33℃时hGM-CSF的最高产量是37℃下hGM-CSF最高产量的6倍。由于培养环境的改变对蛋白的质量有重要的影响，因此研究人员就两种温度下hGM-CSF糖基化进行了测定，将hGM-CSF纯化和去唾液酸化后对其寡糖(oligosaccharide)结构进行测定，检测结果如表1所示。hGM-CSF去唾液酸化后的岩藻糖化没有基本保持不变(16.0→14.2、48.7→50.7%、35.3→35.1%) ；而其去唾液酸后的寡糖结构在温度调节后没有明显变化(18.7→17.0%、32.0→33.4%、32.5→34.0%、16.8→15.6%)，也就表示调节温度对hGM-CSF糖链终端的唾液酸化水平没有明显影响。即在Mariela的实验研究中，将培养温度从37℃(细胞生长阶段)降低至33℃(蛋白表达阶段)可以提高细胞的生长状态，增加hGM-CSF蛋白的产量，同时对hGM-CSF的糖基化影响微弱。

表1 不同温度时hGM-CSF的寡糖结构比较

(图表来自于参考文献5)

剪切力(Shear stress)

细胞培养中剪切力可以被认为是不同流速的、两个层面的培养液间的摩擦力，细胞在这股“力”作用下可能会提前死亡或溶解。有研究报道剪切力可以对蛋白糖基化造成影响，实验室小规模培养时剪切力对细胞表现的影响并不明显，而随着培养规模的扩大又或是细胞的敏感度培养，工艺转移或是放大时剪切力成为一个不得不考虑的因素。

搅拌转速的改变可以直观地影响剪切力，Senger等研究发现高剪切力可以降低tPA上Asn184位点的糖链长度，进而影响蛋白糖基化。Senger研究过程中将tPA的糖基化分为两种类型，Type I(完全糖基化)和TypeII(部分糖基化)，通过Kinetic分析得出高剪切力作用下会产生两个结果：tPA蛋白的产量增加；Type II型蛋白比率增加，Type I型蛋白比率降低，即蛋白总体糖基化比率下降。分析其原因，Senger认为高剪切力造成细胞的提前死亡或溶解，导致tPA在ER(糖基化过程先发生于内质网「ER」，再到高尔基体中进一步加工)的停留时间过短，部分蛋白还未完成糖基化过程就已经被释放到培养环境中，糖基化比率降低。

培养模式

细胞培养模式可分为批培养(Batch)、补料分批培养(Fed-batch)、浓缩补料分批培养(Concentrated Fed-batch)和灌流培养(Perfusion)等，目前应用最多的为Fed-batch模式，Perfusion连续培养模式也渐渐进入人们眼中，培养模式的改进主要集中于控制成本，其对细胞表现及蛋白质量的影响也是需要考虑的因素。

学者Kunkel等在细胞培养模式(Batch, Fed-batch, Perfusion)对细胞生长及蛋白质量影响的研究中发现，培养模式的改变对蛋白糖基化表型具有明显的影响，其采用细胞CHO DG44生产SEAP进行了相关实验。从总体的糖基化比率来看，Kunkel发现与Batch和Fed-batch相比，Perfusion培养模式生产的蛋白糖基化比率最高，其可能与培养系统中谷氨酰胺浓度有关，Batch和Fed-batch培养时低浓度的谷氨酰胺限制了糖基化的位点。

而对于高甘露糖型，其在Batch、Fed-batch和Perfusion模式中的比率依次下降，这是由于培养时间长短不一、细胞存活时间不同(Perfusion > Fed-batch > Batch)，在Batch培养中细胞过早死亡导致蛋白提前从高尔基体中释放，而未完成正常的糖基化修饰。而蛋白SEAP的唾液酸化比率则呈相反的情况，Batch、Fed-batch和Perfusion模式中的唾液酸化比率分别为17.6%、31.6%和50.9%，对于一点作者的解释是较早的细胞死亡或溶解使细胞质中的唾液酸酶得以释放，从而将糖链末端的唾液酸降解，从而减少了唾液酸化比率。

参考文献：

1.Effectsof Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation—What Affects High Mannose 5 Glycoform

2.The Effect of Dissolved Oxygen on the Production and the Glycosylation Profile of Recombinant Human Erythropoietin Produced From CHO Cells

3.Optimisation of the cellular metabolism of glycosylation for recombinant proteins produced by mammalian cell systems

4.Effects of Culture Conditions on N-Glycolylneuraminic Acid (Neu5Gc) Content of a Recombinant Fusion Protein Produced in CHO Cells

5.Temperature Reduction in Cultures of hGM-CSF-expressing CHO Cells: Effect on Productivity and Product Quality

6.Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture