来源：药渡
撰文：五月 编辑：丸子
表观遗传学是指不改变基因序列而导致的表型变化，包括DNA甲基化，组蛋白翻译后修饰，染色质重塑等。组蛋白翻译后修饰是指对组蛋白上的氨基酸进行多种共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化，泛素化和ADP核糖基化等。组蛋白的乙酰化主要发生在赖氨酸残基上，赖氨酸侧链含有氨基，在生理条件下带正电荷，从而能够和含有磷酸基团的DNA紧密结合，被乙酰化后使得正电荷被中和，无法和DNA紧密结合使得染色质结构松散，促进基因的表达。组蛋白的乙酰化动态平衡由大量不同的组蛋白去乙酰转移酶（HDAC）和组蛋白乙酰化酶（HAT）调节。Polycomb 群蛋白（PcG）是一组重要的表观遗传学调节因子，在细胞增殖，干细胞多能性和分化，基因表达异常恶性转化等中起重要作用。PcGs主要含有两种配合物，即多梳抑制复合物1（PRC1）和多梳抑制复合物2（PRC2）。PRC1，由PHCs、BMI1、CBX和RING1B亚基组成，催化组蛋白H2A的单泛素化（图1）1。PRC2复合物包括EZH2，EED，SUZ12和RbAp46/48（图1）。EZH2是一种组蛋白乙酰化酶，它是PRC2复合物中的催化亚基，可以催化组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）三甲基化，诱导染色体凝集，进而抑制靶基因的转录1。EZH2蛋白质结构主要包含五个结合结构域：EED相互作用域（EID），与PHF1和PCL（结构域I）的结合结构域，与SUZ12结合结构域，富含半胱氨酸的结构域（CXC）和SET结构域（图2）2。近年来，EZH2的病理调控机制见于许多疾病，目前已经开发了许多小分子EZH2抑制剂，包括一些被FDA批准上市的药物和一些已进入临床试验不同阶段的抑制剂。EZH2抑制剂目前主要适应症是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkinlymphoma，NHL），而NHL根据细胞形态和病理类型分为弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）和慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞瘤（CLL/SLL）等亚类。据2018年IARC统计，全球NHL新发病例近51万例，占据所有新发癌症病例的2.8%，发病率呈逐渐上升趋势。 单一从非霍奇金淋巴瘤市场看，到2023年，NHL市场预计将达到将近100亿美元。而小分子靶向药物研发成本相对较低，药物可及性强，一旦EZH2抑制剂在发病率较高的淋巴瘤（比如DLBCL、FL）上取得显著疗效和实体瘤上取得突破进展，将会强势竞争和渗透生物药和其他靶点抑制剂的市场份额。临床需求决定研发方向，EZH2抑制剂前景无限。据不完全统计，目前该领域的在研药物四十余种，包括EZH2抑制剂和蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。其中有3款EZH2抑制剂已获批，分别是和黄与Epizyme共同开发的他泽司他（Tazemetostat，EPZ-6438），第一三共的伐美妥司他（valemetostat），以及强生开发的阿司咪唑，除此之外还有多款处于临床前和临床研究的抑制剂（表1）。他泽司他（Tazemetostat，EPZ-6438）2012年，Epizyme通过筛选175，000的高通量化合物库开发了第一个EZH2特异性抑制剂EPZ005687（化合物1，图3），它的结构通过酰胺键连接吡啶酮和吲唑，Ki 值为 24 nM，IC50值为54 nM3。2013年，Epizyme优化了EPZ005687的结构。吡唑的五元环结构断开用苯胺替代，苯胺上的取代基经过SAR分析，发现通过取代乙基和THP获得化合物EPZ-6438（也称为Tazemetostat，化合物2，图3）显示出更强的效力，IC50值为4 nM。与EPZ005687相比，该化合物还显示出良好的药代动力学特性和口服生物利用度。EPZ-6438 对EZH1具有35倍的选择性以及与其他14种 HMT相比，超过> 4500倍的选择性。它对野生型EZH2和EZH2 Y641F、C、H、N、S 和 A677G 突变体表现出很高的体外效力。后续人们基于EPZ-6438结构进行很多的优化和修饰。2015年，Epizyme报道了一种有效且选择性的EZH2抑制剂EPZ011989（化合物3，图3）。对于EPZ011989，EPZ-6438的四氢吡喃部分转化为4-氨基环己胺，吗啉甲基苯基被吗啉丙炔取代。化学结构的这些变化改善了药代动力学和药效学性质。2015年，Zhang等报道了一种新的EZH2抑制剂SKLB1049（化合物4，图3），其核心结构为六氢异喹啉。SKLB1049对EZH2野生型、Y641F和A677G突变体非常有效，IC50值分别为7.3 nM、39 nM和5.9 nM。SKLB1049还显示出对EZH1的12倍选择性。2016年，Song等人报告了一种有效的、高度选择性的、口服生物可利用的EZH2抑制剂ZLD1039（化合物5，图3）。以EPZ-6438结构为基础，用哌嗪吡啶尾取代甲基苯基吗啉，环合吡啶酮C4和C5形成缩合环己烯。2018年，为了降低EPZ-6438的分子量和复杂性，江苏恒瑞公司的研究人员去除了EPZ-6438左侧的苯基侧链，合成了具有苯并呋喃结构的化合物EBI-2511（化合物6，图3）。它不仅表现出高酶和细胞抑制活性，IC50值分别为4.0 nM和6.0 nM，但也具有良好的药代动力学特性。2020年，He等人对SKLB1049的哌嗪甲基苯基（溶剂暴露区）进行了结构优化，用于设计以及合成一系列（E）-2-二苯基乙烯衍生物。最初，在SKLB1049的两个苯环之间加入反式乙烯基。进一步探讨了苯侧链上不同取代基的SAR。初步优化发现化合物7（图3）具有有效的酶和细胞抑制活性，（EZH2 WT，IC50 = 22.0 nM；WSU-DLCL2细胞系，IC50 = 1.61 μM；SU-DHL-4细胞系，IC50 = 2.34 μM）4。美国时间2020年1月23日，FDA宣布批准全球首个EZH2抑制剂Tazemetostat重磅上市，批准的适应症为不适用于手术切除的转移性或晚期的上皮样肉瘤（ES）。除此之外，目前关于EZH2抑制剂Tazemetostat的临床研究有很多，针对不同的疾病或者与其它药物联合使用（表2）。
伐美妥司他（Valemetostat，图4）是一款新型、高选择性first-in-class的EZH1/2双重抑制剂，2021年获得美国FDA的罕见病用药资格认定，是在全球范围内第1个获得监管批准的治疗成人T细胞白血病/淋巴瘤 (Adult T-cell leukemia/lymphoma，ATL) 的EZH1和 EZH2双重抑制剂。表3显示Valemetostat目前临床研究试验。
2012年，GSK通过高通量筛选和结构优化发现SAM竞争EZH2抑制剂GSK126（化合物8，图5A）5。GSK126含有与EPZ005687相同的吡啶酮基团，但其吲哚基团与EPZ005687的吲唑基团不同。GSK126对野生型和突变型EZH2均具有有效的抑制活性，Kiapp = 0.5-3 nM。GSK126对EZH2的选择性是其他20种人甲基转移酶的1000倍。其对EZH1的选择性超过150倍。然而，GSK126缺乏口服生物利用度，因此在小鼠模型和随后的临床试验中需要静脉内（IV）给药。GSK126和PRC2共结晶结构（PDB：5WG6，图5B）显示GSK126中的吡啶酮结构也可以与W624形成两个的氢键。GSK126与F686的苯环有很强的π- π相互作用。其酰胺基团也可与Y111形成氢键。由吡啶基哌嗪组成的“尾部”区域向外指向EZH2和EED之间的溶剂暴露侧。在SAR的指导下，分别合成化合物GSK926（化合物9，图5A），GSK343（化合物10，图5A）和GSK503（化合物11，图5A）。同样，在2012年，诺华公司报告了一种有效且选择性的小型分子抑制剂EI1（化合物12，图5A）。El1与抑制剂GSK126具有相同的吡啶酮和吲哚核心结构。2016年，Zhang等人开发了一种新型有效的EZH2抑制剂JQEZ5（化合物13，图5A）。其核心结构为吡啶酮和吡唑并吡啶。该化合物显示出优异的酶效力EZH2（IC50 = 11 nM）。在75 mg/kg下，JQEZ5显示出GSK-126在150 mg/kg时相同的抗肿瘤活性。2013年，Constellation Pharmaceuticals公司报告了一系列独特的含有四甲基哌啶基苯甲酰胺骨架的EZH2抑制剂，通过高通量筛选发现苗头化合物14（图6），其对WT EZH2具有51 μM的抑制活性，经过优化发现活性化合物17（图6）。2014年，Constellation Pharmaceuticals公司报道了另一种EZH2抑制剂CPI-360（化合物18，图7）。它是一种酰胺连接吡啶酮和吲哚的化合物。它不仅具有出色的抑制活性（WT EZH2 IC50 = 0.5nM），也显示出显着的药代动力学特征。该公司基于此进行进一步的结构优化发现推进临床研究的化合物CPI-1205（图7）和CPI-0209。表3显示 CPI-1205和CPI-0209的临床在研进展。表4. CPI-1205和CPI-0209的临床在研进展
对于一些报道的 EZH2 抑制剂（如 GSK-126、EI1 和 CPI169），吡啶酮通常通过酰胺与双环芳族部分相连。然而，这种结构包含相对大量的平面芳环，通常会损害所获得化合物的溶解度。EPZ-6438只有一个苯环该中心，它在临床上具有良好的应用前景。基于化合物25，辉瑞的研究团队尝试将苯环与酰胺连接起来，分别得到含有七元内酰胺结构的化合物26和含有六元内酰胺结构的化合物27（图8）。进一步优化得到化合物PF-06821497，目前进入临床I期研究，研究对复发/难治性 SCLC、去势抵抗性前列腺癌和滤泡性淋巴瘤治疗效果（NCT03460977）。除了EZH2抑制剂外，人们也开发了EZH2的蛋白靶向嵌合体（PROTACs），如图9所示，使用不同的连接链连接EZH2抑制剂和E3连接酶配体（如VHL配体、CRBN配体和金刚烷）。图9 . EZH2的PROTACs 30-36的结构作为一种重要的组蛋白甲基转移酶，EZH2介导的表观遗传机制紊乱在癌症的发生和发展中得到了深入研究，证实了EZH2是抗癌靶点。通过对EZH2蛋白结构的表征，揭示其SET结构域是其甲基转移酶的主要部分活性和SAM的结合位点。
随着药物化学和结构生物学的发展，越来越多的靶向EZH2的特异性抑制剂被发现。已经有三款抑制剂被批准上市，而且目前临床在研的抑制剂越来越多。Epizyme的EZH2抑制剂Tazemetostat在不到半年的时间内两次获得FDA批准，是表观遗传癌症药物的里程碑，表明EZH2抑制剂在癌症治疗领域的潜力。
虽然有证据表明单独使用EZH2抑制剂可能对某些肿瘤不是很有效，但替代策略的开发，如联合治疗，多靶点药物设计和开发，EZH2的靶向降解和蛋白质-蛋白质相互作用的破坏是高度期待的。
References
1.Qiangsheng Zhang, Hongling Yang, Qiang Feng, Jiaying Cao, Yiqian Zhang, Lu Li, Luoting Yu, Focus on the classical and non-classical functions of EZH2: Guide the development of inhibitors and degraders, Pharmacological Research 178 (2022) 106159.
2.J.A. Simon, C.A. Lange, Roles of the EZH2 histone methyltransferase in cancer epigenetics, Mutat. Res. 647 (1–2) (2008) 21–29.
3..K. Knutson, T.J. Wigle, N.M. Warholic, C.J. Sneeringer, C.J. Allain, C.R. Klaus, J.D. Sacks, A. Raimondi, C.R. Majer, J. Song, M.P. Scott, L. Jin, J.J. Smith, E. J. Olhava, R. Chesworth, M.P. Moyer, V.M. Richon, R.A. Copeland, H. Keilhack, R.M. Pollock, K.W. Kuntz, A selective inhibitor of EZH2 blocks H3K27 methylation and kills mutant lymphoma cells, Nat. Chem. Biol. 8 (11) (2012) 890–896.
4.Jia Zeng, Jifa Zhang, Ying Sun, Jiaxing Wang, Changyu Ren, Souvik Banerjee, Liang Ouyang, Yuxi Wang, Targeting EZH2 for cancer therapy: From current progress to novel strategies, European Journal of Medicinal Chemistry 238 (2022) 114419.
5.M.T. McCabe, H.M. Ott, G. Ganji, S. Korenchuk, C. Thompson, G.S. Van Aller, Y. Liu, A.P. Graves, A. Della Pietra, E. Diaz, L.V. LaFrance, M. Mellinger, C. Duquenne, X. Tian, R.G. Kruger, C.F. McHugh, M. Brandt, W.H. Miller, D. Dhanak, S.K. Verma, P.J. Tummino, C.L. Creasy, EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations, Nature 492 (7427) (2012) 108–112.