司美格鲁肽、替尔泊肽——脂化修饰多肽药物之光
相比于小分子药物，多肽和蛋白质分子不容易穿过上皮细胞并且更容易发生宿主代谢，因此大多数此类生物药只得选择使用皮下或静脉注射给药。相对于非侵入性的给药途径，这无疑会导致更高的成本和更低的患者依从度。而侵入性的给药方式，只是多肽药物面临的众多问题之一，它更大的挑战来自于过短的半衰期，大多数多肽与蛋白质在几分钟到几小时内便被细胞内和细胞外宿主代谢，以及被肾脏从血清中消除[1]。血清半衰期短，加上靶组织吸收缓慢的特性，使得多肽药物通常需要通过增加剂量和频率的方式保证治疗效果，这再一次加剧了成本压力和患者依从度的顾虑。
多肽类药物的另一个掣肘在于它们潜在的免疫原性。蛋白质和肽类药物引发抗药性抗体 (ADA， Anti-drug antibody) 的能力远胜小分子药物，这要归结于它们更大的分子量和更复杂的结构，使得它们更有效地刺激B细胞产生抗体。这些抗药性抗体和其他抗药物免疫反应可能降低药物疗效，并可能导致严重的不良健康影响[2]。
最后，多肽药物在细胞膜上的渗透性往往很差，这通常会导致溶酶体中的药物降解。因此，广大位于细胞内的潜在药物靶点，实际上是目前很多生物制剂可望而不可及的。解决这些关键挑战的一种方法是通过共价修饰给这些多肽药物改头换面，通过赋予其新的物理化学性质的手段，在保留药物活性的基础之上，一一化解上述不利因素，提高其成药性。
多肽药物脂化涉及将脂肪链偶合至多肽分子的适合基团。在自然界中，细胞利用脂化来控制几种蛋白质的功能和细胞内定位。当这种修饰用于多肽药物改性领域时，它可能显著提高多肽分子的半衰期和细胞通透性[3]，而这些优势对于多肽的成药性都是大有裨益的，甚至可以跨越一大步，实现非注射给药的制剂梦想。
尽管比较常见的聚乙二醇PEG修饰也可能实现这些效果，但有结果显示，脂化修饰的优势在某些情况下更胜于聚乙二醇[4]。不仅如此，多肽脂化手段已经结出丰硕果实，有几种脂化修饰的多肽药物已经得到了FDA批准（表1），礼来在2022年上市2型糖尿病注射液tirzepatide也是脂肪酸修饰的多肽药物。药物分子设计者更是给tirzepatide偶合上了庞大复杂的脂肪修饰，除了一个二元脂肪酸本身，中间还嵌入了乙二醇和谷氨酸的结构的单元（图2）。除了这些上市的多肽药物之外，还有更多的脂化多肽药物目前处于不同的临床阶段。脂化的潜在优势主要归因于几个关键作用，提升半衰期、增强递送、给药途径、提高药理效力和降低免疫原性。
表1. 部分脂肪修饰多肽药物
图1. 部分脂肪修饰的多肽药物化学结构（红色椭圆区域为脂肪修饰结构）
多肽脂化可以明显提升药物半衰期，例如，经受脂化修饰的liraglutide (liraglutide对应的就是脂化后的分子，见图1)，其半衰期相较没有脂化的分子提升了约10倍之多（liraglutide半衰期为13小时，而天然GLP-1仅为1.5小时）。而另一款上市脂化多肽，同样是GLP-1类似物的semaglutide（图1）, 其半衰期的提振更为激进，从1-1.5小时猛增至了168小时，提升率甚至超过100倍（或许semaglutide分子N-端第二个氨基酸Aib在半衰期增加的方面也做出了贡献）[5]。
脂化多肽半衰期增加的主要机制是与白蛋白（albumin，图3）的结合。人体白蛋白是一种分子量为66.5 kDa，拥有583个残基的蛋白质，具有非常长的半衰期（20 天）。白蛋白的主要作用是运输血液中例如脂肪酸这样的疏水性分子。脂肪酸修饰就这样带给了多肽分子相当的疏水性，使得它们能够与白蛋白结合并获得它的庇护。与白蛋白的结合，可以增加多肽分子的半衰期，这是通过限制蛋白酶接近多肽-白蛋白结合物实现的（不要忘记白蛋白本身可以抵抗蛋白酶的降解），结合了白蛋白的多肽分子就像穿上了一层防弹衣一样[6]。除此之外，降低肾脏清除率并利用FcRn介导的循环利用来增加半衰期，也是白蛋白发挥作用的机制。
图3. 血清白蛋白结构，来源：PDB
由于脂化多肽与白蛋白的结合是可逆的，因此脂化多肽分子被白蛋白释放之后，它们就可以发挥其药效[7]。重要的是，在正常生理条件下，白蛋白上的7个结合位点中只有2个被脂肪酸占据，从而消除了脂化药物与白蛋白天然携带物产生结合位点竞争的威胁（脂化多肽上的脂肪链倾向结合白蛋白上的脂肪酸）。增加脂化药物上脂肪酸的长度通常会导致更紧密的白蛋白结合，以此进一步增加半衰期[8]。最新的研究方向包括用更长的脂肪酸修饰多肽（18或20个碳），以及二元脂肪酸的介入。
脂化的另一个关键优势是它能够增强药物输送。首先，多肽脂化可以使皮下注射后产生depot，延迟药物吸收。其次，脂化能够改善药物的细胞通透性和吸收。
脂化多肽和蛋白通常通过皮下给药，可在注射部位形成可逆非共价多聚体。这些非共价多聚体的作用就像一个贮库，延迟从注射部位到血液的转移。举个案例，与静脉注射相比，皮下depot的形成几乎可以使liraglutide的半衰期增加一倍[9]。而一旦药物分子进入血液，与白蛋白的结合就会成为延长半衰期的主要机制。
脂化的另一个主要贡献是增加多肽药物的细胞膜通透性（多肽药物分子大多数亲水性较强，因此膜通透性较弱）。脂质基团增加了对细胞膜的亲和力，并且可以插入细胞膜。对细胞膜的亲和力增加也自然会促进更高的细胞摄取，对细胞内递送具有潜在影响。通常增加脂肪链长度，会导致细胞摄取增加。形成稳定的非共价结合多聚体对于膜通透性的增强也有贡献。
脂化多肽的细胞膜通透性增加，还对给药途径的开发产生了深远的影响。尽管口服多肽药物在上世纪就有上市（cyclosporine和desmopressin）, 但脂化修饰为多肽口服制剂打开了一扇更广阔的大门。诺和诺德的2型糖尿病口服多肽制剂Semaglutide（Rybelsus®）的成功（2019年被FDA批准上市）极大地激发了从业者开发口服多肽制剂的热情，而它的成功经验之一正是对GLP-1类似物进行脂肪修饰（图1）。
Semaglutide在口服给药后能够保持很长的半衰期（约153-160小时，而注射后为 168小时）。但口服递送的方式显著降低了它的生物利用度，因此需要更高的每日剂量。未来用于多肽口服药的脂化试剂，可能会寻求比semegluitde (18碳) 更短的脂肪酸（例如12碳），这可能会增加生物利用度。由于与膜的相互作用增加，在胃中不形成稳定多聚体的脂化药物分子，也可能具有更高的渗透性和生物利用度，脂肪链的长度可以控制分子间多聚物的形成倾向。调整脂肪链的结构，或许就是要在生物利用度与半衰期之间寻找一个优化的平衡点。
除此之外，脂化修饰还可以与渗透增强剂结合使用，而这也是Semaglutide（Rybelsus®）带给我们的成功经验，8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠 (SNAC，图4) 作为增强剂在Rybelsus®中得到应用，与脂肪链修饰相得益彰地共同促进了这款口服2型糖尿病药物的问世。
图4. 8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠(SNAC)化学结构
在肽和蛋白质的非侵入性给药途径中，肺具有快速和完全吸收脂化分子的特殊潜力。特别是肺泡上皮非常薄，而且仅被少量液体覆盖，并且通常含有比皮肤或胃肠道低得多的药物代谢酶水平。然而获得审批的吸入性生物制剂目前仍然寥寥无几。脂化多肽药物在肺部递送领域的利用尚未全部展开，正因如此，它也蕴藏着很大的开发潜力和希望。
药物化学结构的修饰理论上会对效力和药理活性产生影响，脂质修饰也不例外。脂肪链长度、多肽氨基酸修饰位点、使用的连接手臂等因素都可能产生关键影响。脂化后的效果是无法单纯从化学结构上预测的，需要具体分析。
脂肪链长度的增加既可能促进药效，也有可能使药效降低。因此对于脂肪链的选择需要进行筛选，不可采取“越长越好”的错误理念。尽管semaglutide和tirzepatide的脂化结构看上去很复杂（图2），但那一定是在经过严格筛选后所选取的公共最佳结构，平衡了各方面的性能指标之后做出的决定。
脂化修饰的位点也很有学问，不同的氨基酸修饰可能会导致截然不同的效果[10]。因此在药物分子设计的过程中，有必要考虑不同具有亲核性的氨基酸残基。除了最常使用的赖氨酸侧链氨基之外，包括N-端氨基与C-端羧基也可以作为潜在的脂化位点。
用于将脂质部分连接到目标多肽的手臂结构，也会影响药物效力。对于效力随着脂肪量增长而降低的分子，使用长亲水性手臂来连接更长的脂肪酸，可以最大限度地降低脂肪链增加对于药效的负面影响[11]。然而，手臂选择如何影响药物效力，通常是不可预测的。常用的连接手臂包括，Glu与乙二醇重复结构的联合使用，tirzepatide和semaglutide都是这样的例子。这些亲水性的手臂可能有助于合成和制剂，可以改善脂化多肽中经常遇见的溶解度问题[12]。
脂化也被证明可以降低潜在生物制剂的免疫原性，这一直是蛋白质疗法临床转化的主要障碍。截至2015年，89%的获批生物制剂报告了一些免疫原性反应，其中55%的反应对治疗效果产生了影响[13]。这些反应包括危及生命的自身免疫、过敏反应和由于形成抗药物抗体 (ADA) 而加速的血液清除[14]。
此外，一些原本旨在增加治疗半衰期的修饰，虽然实现了目的，却又引入了免疫原性，故而限制了疗效[15]。有报道称，接受脂化药物的患者会产生低水平的抗药物抗体，但迄今为止这些抗体的存在并未显示会降低治疗效果[16]。另一方面，在某些情况下，脂化肽的免疫原性甚至低于非脂化肽对应物[17]。
Liraglutide与semaglutide的上市，尤其是后者以口服制剂的形式应用，大大提振了业界人士对于脂化多肽药物的开发热情。尽管取得了这样里程碑式的成就，但对于脂化多肽的药物开发，仍然是路漫漫其修远兮，需要多方面的推动作用以及协同进步。很多领域内的愿景，比如抗体脂化仍未得到充分研究，其潜在的优势尚未被激发出来。
此外，即使在脂化拥有明显优势的应用中，脂化策略的广泛实施依然面临诸多挑战。这些挑战包括：
（1）缺乏脂化对细胞摄取和表皮/内皮通透性影响机制的深刻理解，目前仍多存在于经验层面，并没有上升到理论高度；
（2）缺乏药物脂化对抗原呈递细胞（APC）的作用和免疫原性影响机制的理解。
脂化肽和蛋白质的一个关键研究方面是结构对细胞摄取和渗透性的影响，这个领域的进步有助于更合理的药物分子设计。在这方面，或许细胞穿透肽（Cell penetrating peptides）的研究，可以为多肽药物脂化提供一些理论上指导和实验手段上的支持。更为重要的是，多聚体形态的脂化多肽在细胞渗透性和吸收性方面的研究，也需要进一步加深。
总之，新的脂质化手段，再加上对脂化药物功效机制的更好理解，无疑将推动后浪的不断涌现。新一代脂化多肽药物，或许将具有更多样化和复杂的特性，并且能够根据特定的应用而量身定制，并能将糖尿病以外的其它适应症作为针对目标，加速新药的开发。
参考资料（可上下滑动）：
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专栏作者
哥哈骎
南开大学本科、硕士，德国比勒菲尔德大学博士。多肽化学、多肽API GMP生产专家、欧洲制药公司首席科学家；
拥有Lean Six Sigma黑带认证；
著有专著《Side Reactions in Peptide Synthesis》。
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