来自Nanopore测序的2个线虫基因组，解析复杂的染色体重排
本文使用Oxford Nanopore 测序技术对秀丽隐杆线虫的两个品型（野生型；带有两个复杂染色体重排区域的突变型）进行了全基因组测序，完善了秀丽隐杆线虫参考基因组，研究突变型中复杂的重排机制。2017年12月，文章发表于Genome Research。
秀丽隐杆线虫的基因组虽然较小（~100Mb），但是含有大量各种类型的重复序列，其中最普遍的是转座元件，占到基因组的12%。线虫转座子的大小一般在1-3Kb，超出了二代测序和sanger测序的读长范围，如果利用这两个技术对基因组进行测序组装，会导致拼接错误，更不用说准确识别染色体重排、大区段插入、缺失等结构变异了。
为了攻克这些用以往的短读长测序技术无法解决的技术瓶颈，研究人员使用Oxford Nanopore MinION，对秀丽隐杆线虫的两个品型进行了长读长测序并分别de novo组装。
通过~60×Nanopore数据，组装出野生型秀丽隐杆线虫基因组，仅由48个contig组成，N50达3.99Mb，覆盖了参考基因组>99%的区域。
Fig.1 组装出线虫基因组中的contigs与参考基因组有极高的比对一致性
基于长读长优势，Nanopore与二代测序相比，在重复序列区域具有更好的跨越性，能更准确地识别重复元件，完善了参考基因组中>2MB的序列。
Fig. 2 (A)高测序深度的区域可能与重复序列相关
(B) 通过重复区域测序深度与全基因组测序深度的比较，分析重复区域contigs组装的准确性
(C) 长的测序reads跨越重复序列，增强了contigs组装连续性
原始测序数据准确度~86%，原始canu组装contig单碱基准确度~98%，经二代数据4Xpolish校正后最终达99.8%。
1）II号染色体上xpf-1(e1487)区域重排
该突变由乙醛诱变产生，在xpf-1有复杂的重复和插入引起的重排。
Fig.3左侧纵坐标处为野生型线虫的xpf-1模型，右侧纵坐标为mab-3（~20kb）模型。诱变系的xpf-1重排区域中，复制了mab-3，并将其分2段插入到xpf-1的第二个外显子中（Fig.3中蓝色）。另外，插入片段中较大的那一部分，与xpf-1第二个外显子的一部分侧翼一起，再次发生了复制并形成倒转（Fig.3 中绿色和红色）。
Fig.3 诱变系线虫Ⅱ号染色体上重排区域（xpf-1）示意图
以往的研究只能以寡核苷酸阵列、RT-PCR、反向PCR等技术对该诱变系的染色体重排模型进行预测。而在本研究中，借助Oxford Nanopore全基因组测序，组装出的一个单独的contig(contig017)包含了完整的xpf-1(e1487)重排区域，从而进行更准确地诠释。
2）Ⅲ号染色体上ruIs32区域，外源质粒插入重排
该突变是由基因枪转入的两个质粒引起的基因片段插入。
通过组装的contig1884（Fig.4横坐标）与质粒pAZ132和unc-119的结构（Fig.4纵坐标）进行共线性比对。结果显示，转基因造成的插入，共包括3个拷贝的Ppie-1::GFP::H2B::pie-1和2个拷贝的unc-119(+)（局部）。
Fig.4 contig1884与质粒pAZ132和unc-119间的共线性分析
顺便提一下，研究人员在组装线虫基因组的同时，还装出了2个完整的细菌基因组(Fig.1中的contig14和20），经过比对数据库分析，认为细菌来源于线虫培养基，在提取线虫DNA时未被去除。
这提醒我们，如果是de novo组装基因组，尤其是小型动物，昆虫等物种，须尽可能减少环境微生物和肠道微生物的影响。
当然这也给了我们另一种启示，可以用Oxford Nanopore 技术研究微生物与宿主间的共生关系，研究一个物种的内外微环境等等。
本文利用Oxford Nanopore测序技术提升了线虫参考基因组组装指标，通过de novo组装研究了突变型线虫基因组的复杂染色体重排。以及前期组学君解读的一个人染色体碎裂重排病例，这两篇文献都是将Oxford Nanopore测序技术应用到个体间染色体重排的比较研究。另外我们还可以借助该技术的长读长优势，进行群体间（不同表型间），亚种间（例如不同品种的玉米），种间（例如研究在基因组加倍化事件后趋异的染色体重排，进行物种进化起源分析）等，各水平的比较研究。
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Tyson J R, O'Neil N J, Jain M, et al. MinION-based long-read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome[J]. Genome research, 2017: gr. 221184.117.
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