RNA修饰？APA分析？isoform分配？Nanopore direct RNA一招搞定！

高通量cDNA测序技术极大地提高了我们对转录组复杂性和调控机制的理解。然而，由于经历了反转录过程，天然RNA中所包含的修饰信息往往无法通过cDNA测序获得。可喜的是，基于纳米孔测序的Nanopore平台恰恰可以实现对天然RNA分子的测序，不经反转，无需扩增，同时可以记录RNA链上的碱基修饰信息，真实反映个体转录本的原始信息。组学君今天要和大家分享的是，direct RNA测序如何在人类转录本中的RNA修饰、APA分析及isoform等位基因分配中大展拳脚。

Nature Methods: Direct RNA测序方法测评 ^[1]

Nanopore平台对天然RNA测序的方法测评文章在今年年初正式发表，详细介绍了Nanopore平台在对酵母转录组进行direct RNA测序中的应用，并给出了direct RNA测序的文库制备流程（Fig.1a）。

Figure 1 (a) Direct RNA-seq文库的制备方法；（b）一个转录本通过纳米孔引起的电流信号

此外，文章还指出direct RNA测序还可以从测序信号中直接读取样本的可变多聚腺苷酸化信息（Fig.1b）和碱基修饰信息（Fig.2）。

Fig. 2 合成RNA链上的碱基修饰检测

Direct RNA测序是一种高度平行的、实时单分子测序方法，绕过了反转录和扩增步骤，可获得全长、链特异性的RNA序列，并能直接检测RNA中的核苷酸类似物。

bioRxiv: 人类天然poly(A) RNA转录组测序^[2]

来自约翰霍普金斯大学的研究者利用Nanopore测序技术完成了对人GM12878细胞系中的天然poly(A) RNA分子的直接测序，其研究论文已经预印。通过结合高准确度的二代Illumina测序技术，该研究共鉴定了78,199个高置信度的异构体。同时，研究者提出了基于Nanopore RNA测序技术进行3’端poly（A）尾长度的评估、碱基修饰检测及isoform等位基因分配的策略。

方法流程

Fig.3 （a）Nanopore 天然poly(A) RNA测序流程；（b）具有代表性的2.3 kb TP3 转录本在Nanopore测序中引起的电流信号；（c）数据分析流程

Isoform鉴定

长读长的天然RNA测序可以发现用短读cDNA测序方法难以观察到的RNA异构体。通过结合Nanopore与Illumina平台数据，研究者在GM12878细胞系中发现了65.3%的新的转录本类型，这些在GENCODE v24中是注释不到的。值得注意的是，Nanopore poly (A) RNA数据集检测到的异构体数量没有达到饱和，表明需要更大的测序深度才能全面描述GM 12878 poly(A)转录本(Fig.4)。

Fig.4 GM12878天然poly（A）RNA的isoform水平分析

等位基因特异isoform鉴定

理论上Nanopore RNA测序产生的长读序列应该更容易地分配给亲本的等位基因，因为遇到杂合子的SNP的可能性更大。研究者利用HapCUT2将至少包含两个杂合子变异体的reads分配给他们的亲本等位基因。

研究者在这些数据中挖掘出34个有两种isoform形式的基因，这些基因中>80%的reads以一种isoform形式表达，来源于一个等位基因；而另有>80%的reads以另一种isoform形式表达，来源于另一个等位基因。例如其中的IFIH 1基因，父系isoform中第8外显子保留，而母系isoform不包括第8外显子（Fig.5）。

Fig.5 IFIH 1基因isoform结构

IFIH 1在分配给母系和父系等位基因上的reads大致相等，但母系isoform不包含第8外显子 (绿色框)。

Poly(A)尾长度鉴定

研究者建立了一种计算方法——nanopolish-polya，用来评估转录本中的poly(A)尾长度。采用poly(A)尾分别带有10、15、30、60、80和100个A碱基的合成RNA分子进行nanopolish-polya的测试，评估结果见Fig.6a。该方法也存在一定的局限性，当poly(A)区域在链转换过程中在纳米孔中的停留时则无法准确估算，有可能会造成错估（1-3%的概率会发生），且随着poly(A)尾长度的增加，方差也随之增大。

将nanopolish-polya应用到GM12878转录本中，发现Poly(A)尾的长度主要集中在50nt左右，部分转录本拥有更长的poly(A)尾。而线粒体的转录本的poly(A)尾长度集中于52nt左右，基本不超过100nt（Fig.6b）。

Fig.6 nanopolish-polya的测试及应用

碱基修饰检测

核苷酸修饰会影响RNA的结构、局部电荷和碱基对电位，从而改变其与蛋白质结合的亲和力。m6A是mRNA中常见的修饰形式。研究者利用现有的免疫共沉淀研究来确定Nanopore poly(A)RNA测序数据中可能含有m6A的基因。将真核细胞伸长因子2(EEF2) 的RNA在m6A位点上的原始电流信号与从GM 12878 mRNA产生的体外转录信号进行比较，证实了离子电流的变化是由m6A引起的（Fig.7a）。为了进一步验证这一结果，研究者设计并合成了GGACU METTL3模体中的29个碱基的寡核苷酸序列，包含了m6A修饰和未修饰的腺苷酸（Fig.7b）。Nanopore测序数据显示出来明显的区别(Fig.7c)，与EEEF2的结果一致。

Fig.7 RNA碱基修饰检测

文章指出，Nanopore RNA测序具有两个明显的特征：一是被测序的RNA链依然保留着其在细胞中的天然结构，能够检测到转录后的修饰如碱基修饰和多聚腺苷酸化修饰等；二是读长足够长，可以达到数千个碱基。这种组合具有独特的优势，很可能为RNA的生物学研究带来新的见解。

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[1] Garalde D R, Snell E A, Jachimowicz D, et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods,2018.

[2] Workman, R.E. et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly(A) transcriptome. bioRxiv (2018).

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