超离纯化外泌体？离心方式怎么选？

对外泌体进行有效分离是表征其在微环境调节以及参与疾病病理作用的基础。根据外泌体的大小、形状、密度和表面蛋白，目前已经开发了不同的外泌体分离方法。

超速离心法是最常用的外泌体分离方法学之一，按照其原理差异又可细分为：差速离心法、密度梯度离心法和密度介质垫液离心法。

这三者的离心原理和应用场景各异，今天小 E  就为大家详细介绍上述三种经典离心方法。

#01

差速离心法

差速离心法是最早也是最常报道的外泌体分离方法，2015 年底，一项全球 ISEV 调查^[1] 显示—差速离心法是最常用的初级细胞外囊泡分离和浓缩技术，其他各种技术，如沉淀法、过滤、尺寸排阻色谱和免疫分离各有 5-20% 的受访者使用。

差速离心法的原理是依次通过控制不同的离心力和时间来去除细胞、细胞碎片、微囊泡等杂质。该方法操作过程简单、不会引入其他标记物和试剂、产量高、可处理小到大容量样品。RCF 在 100,000 xg ~ 120,000 ×g 时，外泌体发生沉降，但随之也会沉降大小相似的不同囊泡和可溶性蛋白聚集体，因此离心结束后使用大量 PBS 重复离心洗涤一次，有助于降低外泌体分离过程中的蛋白质污染^[2]。

▲差速离心法分离外泌体示意图^[3]

鉴于细胞外液是高度异质的，差速离心法可能导致非目标外泌体的聚集，因此，用这种方法制备的外泌体往往需要进一步纯化。在转子选择层面，可以优先选择固定角转搭配离心瓶，实现初步高效分离。

Eppendorf CP-NX 系列超速离心机提供多种可用于差速离心外泌体的固定角转，从 24x1.5 mL 的小容量转子到 6x160 mL 的大容量转子，匹配不同样本量的外泌体分离需求。

▲ CP-NX 系列超速离心机 + P70AT 固定角转 + 离心瓶

#02

密度梯度离心法

密度梯度超速离心法是在差速离心法基础上的一种改进技术，它是将样品颗粒加入到具有密度梯度的惰性介质中(如蔗糖，氯化铯)，按原理的细分差异又可分为等密度梯度离心法（分离具有一定密度差的颗粒）和速率区带离心法（分离沉降系数较差的颗粒）。

离心时，不同的颗粒在一定的相对离心力作用下，会集中分布在梯度介质中的特定位置。后续通过对不同组分进行回收，即可纯化出高纯度的目标样本。以等密度梯度离心为例，脂类的密度约为1 g/mL，而蛋白质和 RNA 的密度较高(>1.3 g/mL)，因此，密度梯度离心可用于从上述污染物中精确分离外泌体(1.15~1.19 g/mL)，也可用于分离具有不同脂质、 RNA 和蛋白质比例的外泌体亚群。

▲ 密度梯度离心法分离外泌体示意图^[4]

在整个操作过程中，样本颗粒可以在惰性介质中保持活性，不被挤压或产生变形。该方法获得的样品纯度是三种超速离心方式中最高的。当进行密度梯度离心时，可优先选择水平转子，如果对分离后条带回收的清晰度要求较高，可搭配高洁净度的 PET 材质离心管进行离心。

▲ CP-NX 系列超速离心机 + P32ST 水平吊桶转子 + PET 开口管

#03

密度介质垫液离心法

现阶段，超速离心法结合基于惰性密度介质液（蔗糖，碘克沙醇等）的分离方法变得越来越普遍。以蔗糖密度液为例，蔗糖的密度(1.12 ~ 1.18 g/mL)与外泌体的密度(1.15 ~ 1.19 g/mL)相当，且外泌体在蔗糖溶液中的浮选密度范围相当窄，因此精准制备惰性密度液可以减少高密度蛋白 (1.22 g/mL)和非外泌体，如：凋亡小体或高尔基体来源囊泡的污染^[5]。

此外，这种方式不需要进行密度梯度液的制备，相对省时且可以处理大量的起始样本。在管底铺设的单一密度介质垫液可以起到缓冲作用，有助于维持外泌体的完整性，用此方法分离的外泌体在纯度或形态完整性上都优于差速离心法。

▲密度介质垫液法分离外泌体示意图^[6]

（A）低速离心 CM（条件培养基），去除死细胞等杂质；（B）将预处理过的条件培养基置于 25% 的蔗糖垫上进行超速离心；（C）清洗步骤去除蔗糖和杂蛋白；（D）外泌体表征

值得注意的是，在使用惰性介质垫液进行超速离心时，和密度梯度离心法一样，也应该优先选择水平转子，这样可以使得外泌体在离心过程中从样品溶液中均匀地迁移到惰性介质垫液上，无壁部效应。

▲ CP-NX 系列超速离心机配有多种通量的水平转子

另外，在样品回收过程中，应避免吸取密度垫液和样品层交界处，在配置蔗糖垫液时，有研究者提到：相比于水中制备，在氧化氘中进行蔗糖溶液的制备可减少达到分离外泌体浮选密度所需的蔗糖量，从而降低渗透损害和微生物污染所带来的风险^[6]。

当然，以上三种离心方式也不是一成不变的，根据实际情况进行搭配调整，在纯度和产量的两个维度上进行平衡，可以获得相对满意的纯化效果：

比如，来自卢森堡卫生研究所的研究者采用“两步分离法”，他们首先利用差速离心法从白血病细胞悬液中分离外泌体，并通过超速离心法（110,000  xg，70 min）获得粗提外泌体沉淀；然后在密度梯度(17% Optiprep^™ 缓冲垫)上进行额外的超速离心(100,000 xg，75 min)，PBS 洗涤离心后（110,000 xg，70 min），获得了纯化的外泌体^[7]。

另外加州大学旧金山分校的研究人员将密度介质垫液法（60% Optiprep^™）和密度梯度离心法相结合，最大限度地保证了离心过程中外泌体的纯度和形态完整度^[8]。

▲ 密度介质垫液法叠加密度梯度离心法^[8]

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参考文献：

[1] Gardiner C, et al. J Extracell Vesicles. 2016;5:32945.

[2] Webber J, Clayton A. Journal of Extracellular Vesicles. 2013;2(1):1–6

[3] Yang, Dongbin et al. Theranostics vol. 10,8 3684-3707. 19 Feb. 2020,

[4] Li, Pin et al. Theranostics vol. 7,3 789-804. 26 Jan. 2017, doi:10.7150/thno.18133

[5] Chiou N-T, Ansel KM.Protocol Exchange. 2016.

[6] Faruqu FN et al. J Vis Exp. 2018 Dec 5;(142):10.3791/58814. doi: 10.3791/58814.

[7] Wierz, Marina et al. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) vol. 1884 (2019): 231-245.

[8] Li K, et al. (2018) Methods Mol Biol 1740:69-83