量身打造！RNA-Capseq更适合临床融合基因检测 | 经典文献分享
基因融合或易位可能产生功能改变的嵌合蛋白，也可能重新排列基因启动子，通过激活原癌基因或抑制抑癌基因导致细胞信号通路紊乱，它们在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角色。[1,3] 例如，BCR–ABL1融合会导致酪氨酸激酶活性以及下游PI3K和MAPK信号通路的组成型激活，使细胞逃避凋亡，实现无限增殖。
图1. 基因融合致癌机制[1,3]
50多年前，BCR-ABL1融合首次在慢性粒细胞白血病中被发现。除血液恶性肿瘤外，技术的进步使得基因融合也在许多实体瘤中得以发现，包括甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和肾癌等。特别是下一代测序(NGS)的出现，从根本上改变了癌症基因融合的发掘模式。在目前已报道的近10,000个基因融合中，有90%是通过NGS方法鉴定，包括DNA测序(DNA-seq)和RNA测序(RNA-seq)。通过对TCGA中代表13种肿瘤类型的4300个原发肿瘤样本的转录组数据分析发现，有7%的样本存在框内激酶融合。更重要的是，可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1%~9%，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR（图2）。
图2. 融合基因在不同癌症中的分布[1,4]
随着精准医疗进程的深入，融合基因靶向药物种类和适应症正在不断增加， ALK和ROS1被证明是治疗非小细胞肺癌的有效靶点。此外，RET、NTRK1和BRAF重排已在临床上成功用于靶向治疗。例如，针对NTRK融合突变的泛癌种靶药Vitrakvi（larotrectinib）已获得FDA批准；由Roche公司开发的“不限癌种”个体化药物Rozlytrek（entrectinib）也获得日本厚生劳动省（MHLW）批准，用于治疗携带NTRK基因融合的晚期复发实体瘤患者。虽然携带融合基因靶点的患者比例较低，但由于癌症人群基数大，可能获益的患者数量仍然可观。因此，快速、准确、全面的鉴定融合基因谱可以为患者带来更优的医疗决策。
表1. FDA批准的融合基因靶向药（部分）
目前，融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR等方法。虽然这些方法灵敏度高，但通常只检测单个融合基因的存在，诊断过程漫长、且费用昂贵。此外，这些方法不能识别新的融合基因伴侣或解决复杂的结构重排，这也是导致假阴性结果的主要原因[5]。
理想的融合基因临床检测应具备以下特点：
1）能够耐受低质量RNA样本，比如FFPE RNA；
2）具有更高的灵敏度，能够应对低表达的融合基因或正常细胞转录本的稀释；
3）可以一次检测多个基因，且具有发现新融合亚型的能力，因为融合基因伴侣的数量多、融合位点复杂多变（图3）；
4）成本较低，患者能够承担，同时节约公共医疗资源；
5）具有良好的技术拓展性，根据临床研究和药物研发的新进展，可快速更新迭代，适应临床需求。
图3. 融合基因亚型较多 [3,4]
RNA-seq也分为全转录组测序和靶向转录组测序。在科研中，尽管全转录组RNA-seq（poly（A）和去核糖体）展现出广泛的潜力，但由于其样本质量耐受度低、成本高，并不适合用于个体患者的常规临床检测。具体而言，poly（A）RNA-seq在对降解的RNA样本测序时，偏好覆盖转录本3’端，融合位点离3’端越远便越难检测。如图4所示，BCR-ABL融合位点距离ABL1转录本3’端5.3Kb，仅当RIN值下降到7时，断裂位点附近已经没有Reads覆盖。当RIN值低于4时，poly（A）RNA-seq对融合基因检测的灵敏度已经降至50%左右[6]。换言之， RNA-seq poly（A）的融合基因检测灵敏度严重依赖于RNA样本的完整程度。
图4. poly（A）RNA-seq对转录本覆盖依赖RNA样本完整度[5,6]
此外，去核糖体RNA-seq（下文简称RD-RNA-seq）虽然可以获得更为完整的转录本，但RD-RNA-seq测序成本较高，主要是由于编码区数据占比较少，rRNA去除效果不稳定，同时还存在原核RNA污染的风险。
图5. poly（A）RNA-seq和RD-RNA-seq数据分布示意图
与DNA-seq一样，在RNA-seq中也有两类靶向测序方法，分别基于PCR和杂交捕获（下文简称RNA-Capseq）。PCR靶向测序有一定的局限性，无法事先明确融合基因和断裂位点。尽管有报道通过锚定PCR技术进行了优化，但该技术本身的拓展性仍然不如RNA-Capseq [7]。2009年，Levin等人首次利用RNA-Capseq从肿瘤样本的cDNA文库中捕获467个肿瘤相关基因，具有较高的特异性，能够发现新的嵌合转录本，并同时分析转录本表达[8]。2011年，Mercer等人证实RNA-Capseq在低丰度转录本的分析中具有明显优势。2014年，Mercer团队进一步对RNA-Capseq技术进行了系统升级，RNA起始量降低30倍，从3μg下调为100ng。如图6所示，在低质量FFPE RNA样本中，RNA-Capseq对转录本的测序深度和覆盖均一性均明显优于poly（A）RNA-seq。研究人员很快意识到， RNA-Capseq更加适合临床样本的融合基因检测。
图6. 基于杂交捕获的RNA-Capseq可耐受高挑战样本[9,10]
与WGS适用于NIPT一样，RNA-Capseq可谓是为融合基因检测量身打造，具有耐受低质量RNA样本、高灵敏度、高基因通量以及Panel易于延伸拓展等优势。如图7所示，其检测原理是根据覆盖融合位点附近的嵌合Reads来预测融合的发生。
图7. RNA-Capseq检测融合基因示意图[11,12]
因此，近年来，RNA-Capseq已被建议作为实体瘤和血液肿瘤的融合基因诊断方法 [12,13]。2016年，He等人验证了RNA-Capseq在血液恶性肿瘤融合基因检测中的表现。2017年，Reeser工作小组验证了RNA-Capseq在实体瘤融合基因检测中的性能，该方法对93个激酶和转录因子基因的完整转录本进行了检测。在74个阳性和36个阴性对照样本中，RNA-Capseq融合检测的敏感度为93.3%，特异性为100%。将该方法应用于前瞻性患者样本，发现OLFM4作为新的RET融合伴侣，并在一名前列腺癌患者中发现KLK2-FGFR2融合，该患者随后接受了泛成纤维细胞生长因子受体抑制剂的治疗。除融合检测外，该方法还可以提供基因表达分析、单核苷酸变异检测和选择性剪接识别等多种分析。
图8. RNA-Capseq应用于临床融合基因诊断[12,13]
最后，再给大家分享一篇经典的关于RNA-Capseq应用于肿瘤融合基因检测的文献。研究小组在细胞系和人工标准品中，对采用实体瘤和血液肿瘤2种Panel的RNA-Capseq方法进行了实验和信息分析优化。随后，对该方法进行回顾性验证（n=72），结果显示，其融合基因诊断率较传统方法提高13%。此外，该研究还进一步尝试采用RNA-Capseq分析免疫组库，全面呈现了RNA-Capseq改善临床融合基因检测的巨大潜力。
图9. RNA-Capseq应用于血液和实体瘤癌症的融合基因诊断[11]
1. 实验方法
文库构建和杂交捕获：细胞系和临床样本RNA投入量分别为4μg和100-1000ng，预文库构建和杂交捕获分别采用Roche KAPA链特异文库构建试剂盒(#07277261001)和Roche杂交捕获试剂盒SeqCap EZ Accessory Kit v2 #07 145 594 001; SeqCap EZ Developer Enrichment Kit #06 471 684 001; SeqCap EZ Hybridisation and Wash Kit #05 634 261 001）。
探针设计及合成：经验根据文献和公开数据库选择目标基因，鉴于Roche探针的超多重叠瓦设计、融合基因探针设计算法以及积累多年的探针数据库等优势，从Roche合成实体瘤和血液肿瘤Panel探针（探针基因组成如图9所示）。
2. RNA-Capseq数据表现
On-target为~ 50%（一次捕获）和93%（二次捕获），血液肿瘤Panel的On-target略高于实体瘤Panel（中位数99.3 v 94.7,）。更为重要的是，FFPE与新鲜冷冻组织（FFT）的On-target无显著差异，表明即使是具有挑战性的FFPE组织也可以通过RNA-Capseq进行靶向富集。两种Panel的转录本覆盖均匀性良好。此外，血液肿瘤和实体瘤Panel对已知剪接位点的覆盖分为77.8和84.6%。以上研究结果表明， RNA-Capseq中的两种Panel均具有检测大部分基因易位的能力(图10)。
图10. 血液和实体瘤Panel的RNA-Capseq数据表现
3. 融合基因检测
在评估了多个融合基因分析工具后，研究人员最终确认STARfusion和Fusioncatcher两种算法同时检测到融合基因作为判定条件。RNA-Capseq成功检测到6个细胞系中所有的已知融合基因。值得注意的是，RNA-Capseq检测融合基因并不需要同时靶向两个融合基因伴侣(图11 d)，表明RNA-Capseq捕获和识别新的非靶向融合伴侣的能力。更为重要的是， RNA-Capseq在检测低丰度融合基因时，较标准RNA-seq具有明显的优势。例如，在BCR-ABL1融合基因的检测时（8-24 DNA拷贝-K562），两种方法没有明显差异；当检测EWSR1 - FLI1融合基因时（单个DNA拷贝-RDES），标准RNA-seq对融合位点已经没有reads覆盖，说明靶向富集对于低丰度融合基因检测具有独特的优势(图11 b)。
图11. d. 人工合成标准品投入量与融合位点Reads相关性散点图；b. RNA-Capseq与标准RNA-seq对不同表达量的融合基因的融合位点覆盖情况。
4. 基因表达检测
采用3x3x3（3 Sample；3 Cap；3 Seq Lane）方式评估RNA-Capseq对临床样本基因表达检测的重现性。实验结果表明，批内和批间重复稳定，平均变异系数分别为0.073和0.071。此外，聚类分析结果也表明基因表达检测的高重复性。有趣的是，较内源融合伴侣，基因融合后往往出现更高的表达，例如，与未融合的EZR和ROS1基因相比，EZR-ROS1融合基因表达量较高，暗示还存在其他调控方式 (图12 A)。更为重要的是，即便RNA-Capseq不能直接检测到融合不同基因上游启动子的染色体重排，但它仍可能检测到由此导致的基因表达变化。例如，在一个RNA-Capseq无法确认融合基因的肉瘤患者中，先前的诊断结果为ROS1染色体重排，RNA-Capseq表达量分析显示，ROS1表达式是其他肉瘤样本的50倍 (图12 B)。
图12. A. EZR-ROS1融合基因的表达量明显高于未融合的EZR和ROS1基因；B. 启动子易位导致ROS1高表达量。
5. 免疫组库分析
由于一系列血液肿瘤中涉及IG/TCR受体基因座的融合基因，因此该研究也在血液Panel中加入了针对V、J和C外显子的探针(图13 a)，并利用血液Panel在患者队列中确认了3例携带IGH-MYC或IGH-BCL6融合基因的淋巴瘤患者。除了融合基因检测，这些探针还捕获了免疫受体表达的转录本(图13 a)。接下来，研究人员还评估了血液Panel在细胞系和临床样本中解析免疫组库的能力。在临床队列的32例血液病患者样本(29例癌变和3例健康)中，大多数肿瘤和正常样本表达了数百种不同的免疫受体克隆型，每个克隆都有少量的reads(图13 b)。在骨髓样本中， IG克隆比TCR克隆更多，反映了骨髓中成熟B细胞的多样性(图13 b)。值得注意的是，在29个肿瘤样本中，有2例的T/BCR克隆数远多于其他样本（10x/100x），这可能反映了恶性T细胞和b细胞克隆群的存在(图13 b)。
图13. a. TCR/BCR 探针设计示意图 b. 用MiXCR对细胞系和临床患者样本中的免疫受体克隆型进行定量
产生融合基因的染色体易位是导致癌症的重要原因，其准确诊断对有效治疗至关重要。然而，传统方法，如FISH和RT-PCR依赖于先验数据库，通量和分辨率较低。因此，通常只针对最常见的融合基因，可能需要反复检测，并极有可能导致治疗延误或误诊。
与此前的技术相比，RNA-Capseq能够在一次检测中评估数百个基因，提供高分辨率的融合基因检测，能够同时识别已知和新的融合基因。虽然NGS检测流程较长，但这种多基因“宽度”可以缩短诊断时间，同时提高诊断率。鉴于这些优点，RNA-Capseq越来越多地被用于融合基因的诊断。
图14. 多种融合基因检测技术路线对比图
然而，尽管RNA-Capseq的高通量特性为癌症诊断提供了更广泛的途径，但事实上，假阳性率较高仍是我们面临的一个重大挑战。但我们相信，随着技术的不断完善，RNA-Capseq将为患者提供更细致的治疗和预后措施，为患者提供更好的护理。
参考文献
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