“超越CRISPR”的重大突破！David Liu团队发表新型基因编辑工具，有效减少脱靶效应

目前，CRISPR–Cas9基因编辑工具虽然可以轻松地改变基因组，但其容易导致脱靶效应等意想不到的编辑后果。为更好地控制基因编辑的进行，科学家们在开发不同的替代方法方面进行了不懈的努力。

2019年10月21日，单碱基编辑技术开创者、Broad研究所David Liu教授研究团队在顶级学术期刊Nature发表了最新的基因编辑研究成果，报道了一种被称为“prime editing”的新型基因编辑技术。该技术可直接靶向点突变，进行精准插入、精准删除以及各种基因编辑，且不造成DNA双链断裂，增加了可执行基因组编辑的类型，有效减少了脱靶效应。此外，该技术有望修复大约90%的已知人类致病基因突变，为基因疗法更安全地应用于临床提供了技术支持。该文章题为“Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”。

David Liu教授

图：prime editing基因编辑方法。将Cas9（蓝色）和逆转录酶（红色）这两种酶与一个gRNA（绿色）结合，该RNA可将复合物带到DNA双螺旋结构的特定位置（黄色和紫色） 并且还拥有在该位置插入新DNA的代码。

脱靶效应是基因编辑面临的一项重大挑战。该基因编辑技术的核心之一是一种由Cas9蛋白与逆转录酶融合而成的特殊蛋白。另一个关键是一种特殊的gRNA——pegRNA。pegRNA不但能够结合目标基因的特定DNA区域，还自带基因编辑模板。在pegRNA的引导下，Cas9-逆转录酶融合蛋白可以精准地切开一条DNA链，然后根据模板，合成正确序列的DNA序列。随后，细胞自身的DNA修复机制会自动将新的DNA序列整合进基因组。同样，在另一条DNA链上也进行相同的基因编辑，就可以使两条DNA链都得到来源于pegRNA的正确编码信息，并且不必断裂DNA的两条链。该基因编辑是永久性的改变。

此外，得益于prime editing技术的灵活性，研究人员可以实现任何碱基的转化，即12种单碱基的转化，包括T to A。其他的单碱基编辑系统只能进行4种碱基的转化。

图：prime editing的基因编辑过程

为验证prime editing的基因编辑能力，研究人员在多种人类细胞和小鼠神经元中进行了170种以上的试验。结果显示，prime editing不仅可以进行单碱基编辑，还能够插入或删除特定的DNA序列，最多可以插入44个碱基，或删除80个碱基，并且脱靶编辑风险更低。值得关注的是，研究团队利用prime editor成功修复了导致镰状细胞性贫血症和Tay-Sachs病的基因突变。

David Liu表示：“prime editing的优势在于几乎对编辑的序列没有限制，碱基的改变仅由pegRNA来决定。这种最新基因编辑工具能够实现特异性基因编辑，还能帮助研究人员更容易在实验室中开发疾病模型或研究特定基因的功能。”据David Liu估计，prime editing可以帮助研究人员解决ClinVar公共数据库列出的75,000多种疾病相关DNA变异中的约90％。这意味着，prime editing或可用于开发针对致病基因突变的治疗方法。

对于prime editing研究成果的发表，Science杂志发表评论，称其是“超越CRISPR”的重大突破。CRISPR先驱、哈佛大学George Church教授表示：“是基因编辑朝着正确方向迈出的一大步。”

普林斯顿大学DNA修复和基因编辑专家Brittany Adamson表示：“虽然现在还为时尚早，但该研究的初步结果看起来非常理想。”

马萨诸塞大学分子生物学家Erik Sontheimer认为：“prime editing可能无法像CRISPR-Cas9那样进行较大的DNA插入或删除，因此不太可能完全取代成熟的基因编辑工具。因为研究人员想要进行的任何改变都是在一条RNA链上编码的，RNA链存在的时间越长，被细胞酶破坏的可能性越大。不同类型的基因编辑仍需要不同类型的基因组编辑平台。但prime editing似乎比迄今为止开发的其他CRISPR替代方法更加精确和通用。”

目前，David Liu研究团队已向学术界和非盈利组织免费公开这一系统，以进行进一步的检验和改进。此外，基于prime editor基因编辑系统，David Liu已经创建了新公司Prime Medicine。

参考资料：

1.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4 (2019).

2.Super-precise new CRISPR tool could tackle a plethora of genetic diseases

3.New ‘prime’ genome editor could surpass CRISPR

4.New “Prime Editing” Method Makes Only Single-Stranded DNA Cuts

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