学术成果 | 多组学研究揭示磨玻璃肺结节惰性生长的分子特点

肺癌是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，虽然靶向、免疫治疗等前沿技术在临床的应用普及，明显延长了肺癌晚期患者生存期，但总体五年生存率仍不容乐观，早发现、早诊断、早治疗逐渐成为大家的共识。近年，随着低剂量薄层CT和高分辨率CT的普及和筛查，肺结节的检出率不断攀升，引起临床上的广泛重视。这些肺结节在影像学上表现为三种形态：实性结节(Solid)、亚实性结节(Part solid)、以及纯磨玻璃结节(Non-solid)。其中，带有磨玻璃样的结节（以下统称为GGO，包括亚实性结节和纯磨玻璃结节）是指在胸部 CT中表现为密度轻度增高的云雾状结节，且不遮盖内部的血管和支气管结构，在生物学上呈现惰性的生长行为，普遍预后较好，但其背后的分子机制尚未完全阐明。目前，临床上针对GGO结节的诊治规范尚存争议，医生经常根据个人经验选择手术切除或随访观察。

近日，北京大学人民医院胸外科王俊院士、杨帆教授团队领衔，联合美国德克萨斯大学MD Anderson癌症中心张建军教授团队，中国医学科学院肿瘤医院程书钧院士团队，吉因加开展了一项前瞻性的队列研究。该研究利用多组学策略，研究GGO结节和实性结节的分子及免疫微环境的特征，相关研究成果“Multiomics analysis reveals distinct immunogenomic features of lung cancer with ground-glass opacity”发表于国际知名期刊American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine（IF= 21.405）。

主要发现

该研究通过前瞻性队列入组101例良恶性肺结节患者。采集患者的手术组织和配对外周血，进行基因组（1021-panel靶向捕获测序）、转录组、免疫组库、ctDNA高深度测序等多组学检测 ，对队列中的磨玻璃结节与实性结节进行多维度的对比，全面揭示磨玻璃型肺结节特有的基因组及免疫微环境特征。同时结合影像学三维重构技术，精确计算手术组织的磨玻璃成分及实性成分，进行多组学的GGO动态分析。

图1  研究设计流程图

图2 纯磨玻璃结节和亚实性结节的三维重构示例

研究结果

1、入组患者的基因组图谱

良性结节未检测到功能性突变，恶性结节存在至少一个点突变或结构性变异（图A）。和实性结节相比，磨玻璃型结节的肿瘤负荷更低 (图C，TMB：实性结节 6.71 Mut/Mb vs 混合性结节3.08 vs 纯磨玻璃结节 1.85 Mut/Mb)。82例肺腺癌中，高频突变基因有EGFR (63.4%), TP53 (34.1%), KRAS (15.9%), and PIK3CA (11%)。随着GGO成分的减少，KRAS，PI3KCA等驱动基因的发生率逐渐增加（图D）。

图3 肺结节组织突变全景

2、肺结节的免疫微环境特征

通过RNA-seq数据对免疫细胞进行无监督聚类，将患者分为：高免疫浸润组和低免疫浸润组。发现磨玻璃型结节主要富集在低浸润组(图A，p=0.025)，伴随着免疫相关的Marker基因低表达，而这些免疫活性基因在实性结节中表达较高 (图B-C, CD8A, IFN-r以及溶细胞活性)。多重免疫荧光实验也证实了磨玻璃型结节的免疫细胞浸润较低（图D-E，CD3, CD4, CD8, FoxP3）。研究者发现，大部分免疫细胞在磨玻璃型结节中浸润较低，而嗜酸粒细胞的浸润程度非常高，伴随着一些与粒细胞成熟相关的基因高表达(DAPK2，CSF3R)，而之前的研究发现，嗜酸粒细胞在过敏反应或炎症反应中会招募Th2细胞。相反，Th1相关的基因在磨玻璃型结节中则表达下调，如IFN-g和TNF-a。因此，推测在GGO结节中，会出现Th1/Th2向Th2偏移，这也可能是导致癌症免疫耐受的原因。

图4 免疫细胞浸润

3、肺结节的TCR 免疫组库特征

TCR免疫组库可以反应宿主的T细胞应答强度及多样性，对组织和血液分别进行IR-seq检测，组织中检测到的unique TCR克隆类型为1456个（中值），血液中检测到6840个（中值）。研究发现，组织中磨玻璃型结节的寡克隆性与良性结节类似，比实性结节更低。Top10克隆扩增的比例可反应出T细胞克隆强度，研究者发现，磨玻璃型结节的Top10克隆扩增比例与良性结节无差别，比实性结节更低(图A)。说明磨玻璃型结节的T细胞克隆扩增较低，不如实性结节活跃。而在血液中，良性结节、磨玻璃型结节与实性结节的 T细胞多样性、T细胞寡克隆性以及Top10克隆扩增比例无明显变化（图B）。与健康人相比，肺结节患者的血液呈现了更高的寡克隆性，而多样性较低，推测这些肺结节患者均出现了一定程度的抗原特异性T细胞扩增。与实性结节相比，这些磨玻璃型结节患者的组织与配对血液中共享更多的T细胞克隆（图C）。

HLA的杂合性缺失(HLA LOH) 是免疫逃逸机制之一，HLA的杂合状态也能反应出机体的抗原识别能力。研究发现31%的肺癌患者发生了HLA LOH事件，而且该事件的发生无HLA-I类基因的偏好性（图D，p=0.029）。在磨玻璃型结节中，HLA LOH的发生率较实性结节更低 (图E)，而HLA的杂合状态与结节上是否存在磨玻璃无关（图F，p=0.87）。

图5 免疫组库和HLA状态

4、肺结节患者的ctDNA入血探索

对血浆样本进行高深度的靶向捕获测序 (图A，平均深度25698x)，发现磨玻璃型结节的cfDNA浓度与良性结节无差别，而显著低于实性结节(图B)。利用tumor-informed的策略，共有35/85例肺癌患者的血液中检测到cfDNA突变，其中磨玻璃型结节患者的血浆检出率为27%，而实性结节患者血浆的检出率为49% (图C)，腺癌的ctDNA入血率低于非腺癌（图D，p=0.01）。与肿瘤整体的体积相比，ctDNA的检出率与肿瘤的实性体积更相关，进一步说明磨玻璃成分的肿瘤更少释放ctDNA入血（图E）。

图6 肺结节血浆样本的ctDNA检测

研究结论

研究结果显示，与实性肺癌相比，GGO型肺癌肿瘤负荷低，释放更少的肿瘤相关新抗原，无法被免疫细胞识别，且存在较少的免疫逃逸。但又时时处在免疫系统的清除压力下，因而不能过度生长，处于免疫编辑理论的第二阶段——“免疫平衡”阶段, 可能是其惰性临床表现的主要原因。

随着GGO成分的减少，实性成分的逐渐增加，会积累更多基因产生突变，释放更多的新抗原被免疫系统识别到，因此免疫细胞浸润更强，同时伴随着HLA LOH等更多的免疫逃逸事件，且ctDNA逐渐释放入血。当产生的“积累效应”达到一定程度时，打破平衡，使免疫系统与肿瘤的关系逐渐进入“免疫逃逸”阶段，肿瘤细胞开始快速生长。研究从多个维度揭示了磨玻璃肺结节惰性生长的分子机制，为此类患者的诊治提供了重要的参考。

图7 整合不同GGO状态的基因组和免疫微环境特征

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参考文献：

1.Chen K, Bai J, Reuben A, et al. Multiomics Analysis Reveals Distinct Immunogenomic Features of Lung Cancer with Ground-Glass Opacity. Am J Respir Crit Care Med. 2021 Nov 15;204(10):1180-1192. doi: 10.1164/rccm.202101-0119OC. PMID: 34473939.

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